Идентификация типа волокна скелетной мускулатуры человека
Summary
Этот протокол демонстрирует выделение одного волокна из лиофилизированных скелетных мышц человека и классификацию типов волокон в соответствии с изоформой тяжелой цепи миозина (MHC) с использованием метода точечного блоттинга. Идентифицированные образцы клетчатки MHC I и II могут быть затем дополнительно проанализированы на предмет специфичных для типа волокна различий в экспрессии белка с помощью вестерн-блоттинга.
Abstract
Описанный здесь метод может быть использован для идентификации специфических изоформ тяжелой цепи миозина (MHC) в сегментах отдельных мышечных волокон с помощью точечного блоттинга, далее именуемого обнаружением тяжелой цепи Myosin методом лоттинга Dot Bдля идентификациитипа мышечных волокон (MyDoBID). Этот протокол описывает процесс сублимационной сушки скелетных мышц человека и выделения сегментов отдельных мышечных волокон. С помощью MyDoBID волокна I и II типов классифицируются с помощью MHCI- и IIa-специфических антител соответственно. Затем классифицированные волокна объединяются в специфичные для каждого типа образцы волокон для каждой биопсии.
Общий белок в каждом образце определяется с помощью додецилсульфатного полиакриламидного гель-электрофореза (SDS-PAGE) и технологии УФ-активированного геля. Тип образцов волокна валидируется с помощью вестерн-блоттинга. Также описана важность нормализации белковой нагрузки для улучшения обнаружения целевых белков при множественных вестерн-блоттингах. Преимущества консолидации классифицированных волокон в образцы для конкретных типов волокон по сравнению с одноволоконными вестерн-блотами включают универсальность образцов, повышенную пропускную способность образцов, более короткие временные затраты и меры по экономии средств, сохраняя при этом ценную информацию о типе волокна, которая часто упускается из виду при использовании гомогенизированных образцов мышц. Целью протокола является достижение точной и эффективной идентификации волокон I и II типа, выделенных из лиофилизированных образцов скелетных мышц человека.
Эти отдельные волокна впоследствии объединяются для создания образцов волокон типа I и типа II. Кроме того, протокол расширен и включает в себя идентификацию волокон типа IIx с использованием актина в качестве маркера для волокон, которые были отрицательными для MHCI и MHCIIa, которые подтверждены как волокна IIx с помощью вестерн-блоттинга. Каждый образец клетчатки, специфичный для конкретного типа, затем используется для количественной оценки экспрессии различных белков-мишеней с помощью методов вестерн-блоттинга.
Introduction
Скелетные мышцы представляют собой гетерогенную ткань с различными клеточными метаболическими и сократительными свойствами, которые зависят от того, является ли клетка (волокно) медленно сокращающейся (тип I) или быстро сокращающейся (тип II). Тип волокна может быть идентифицирован путем изучения изоформ тяжелой цепи миозина (MHC), которые отличаются друг от друга по нескольким параметрам, включая время сокращения, скорость укороченияи сопротивление усталости. Основные изоформы MHC включают тип I, тип IIa, тип IIb и тип IIx, и их метаболические профили являются либо окислительными (типы I и IIa), либо гликолитическими (IIx, IIb)1. Пропорция этих типов волокон варьируется в зависимости от типа мышц и между видами. Тип IIb широко встречается в мышцах грызунов. Мышцы человека не содержат волокон типа IIb и состоят преимущественно из изоформ MHC волокон I и IIa, с небольшой долей волокон IIx2. Профили экспрессии белков варьируются в зависимости от типа клетчатки и могут изменяться с возрастом3, физической нагрузкой 4,5 и заболеванием 6.
Измерение клеточных реакций в различных типах скелетных мышечных волокон часто упускается из виду или не представляется возможным из-за исследования мышечных гомогенатов (смесь всех типов волокон). Одноволоконный вестерн-блот позволяет исследовать несколько белков в отдельных мышечных волокнах7. Эта методология ранее использовалась для получения новых и информативных одноволоконных характеристик, которые невозможно было получить с помощью гомогенатных препаратов. Тем не менее, существуют некоторые ограничения оригинальной методики вестерн-блоттинга с одним волокном, в том числе трудоемкий характер, невозможность создания репликаций образцов и использование дорогостоящих, чувствительных реагентов усиленной хемилюминесценции (ECL). Если используется свежая ткань, этот метод дополнительно ограничен из-за временных ограничений, связанных с необходимостью изолировать отдельные волокна в течение ограниченного периода времени (например, 1-2 часа). К счастью, это ограничение смягчается путем выделения одноволокнистых сегментов из лиофилизированной ткани8. Однако сбор клетчатки из лиофилизированных образцов ограничен размером и качеством биопсированной ткани.
Идентификация типа волокна с помощью метода точечного блоттинга9 была значительно усовершенствована и расширена в этом комплексном протоколе. Ранее было продемонстрировано, что всего ~2-10 мг мышечной ткани с влажной массой достаточно для сублимационной сушки и анализа изоформы белка MHC с одним волокном9. Christensen et al.9 использовали 30% сегмента волокна ~1 мм для обнаружения изоформы MHC, присутствующей с помощью точечного блоттинга, что было подтверждено вестерн-блоттингом. Эта работа показала, что при замене вестерн-блоттинга на точечный блоттинг общие затраты были снижены в ~40 раз (для 50 сегментов волокна). Затем волокна были «объединены» в образцы типа I и типа II, что позволило провести экспериментальную репликацию9. Тем не менее, ограничением было то, что были получены только два образца волокон, специфичных для конкретного типа: тип I (MHCI положительный) и тип II (MHCII положительные волокна), при этом образцы типа II содержали смесь MHCIIa и MHCIIx 6,10. Примечательно, что текущий протокол демонстрирует, как могут быть идентифицированы чистые волокна типа IIx, и предоставляет очень подробный рабочий процесс (см. рис. 1), включая стратегии устранения распространенных проблем протокола.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сбор клетчатки
Основываясь на многолетнем опыте, большинство исследователей могут освоить эту технику; Тем не менее, практика приводит к более быстрому и эффективному сбору волокна для последующего анализа. Чтобы можно было выделить 30 отдельных сегментов волокна определен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Антитела против MHC I (A4.840) и MHCIIa (A4.74), использованные в этом исследовании, были разработаны доктором Х. М. Блау, а антитела против MHCIIx (6H1) были разработаны доктором К. А. Лукасом и получены из Банка гибридом исследований развития (DSHB) благодаря поддержке Национального института детского здоровья и развития человека и поддерживаемому Университетом Айовы. Факультет биологических наук (Айова-Сити, штат Айова). Мы благодарим Викторию Л. Виккельсма (Victoria L. Wyckelsma) за предоставление образцов мышц человека для этого исследования. Большинство изображений на рисунке 1 были получены из BioRender.com.
Финансирование:
Это исследование не получило внешнего финансирования.
Materials
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
- Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
- Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
- Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
- Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
- Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
- Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
- Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
- Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
- Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
- Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
