ヒト骨格筋の線維型同定
Summary
このプロトコルは、ドットブロッティング技術を使用して、ミオシン重鎖(MHC)アイソフォームに従って、凍結乾燥したヒト骨格筋および繊維タイプの分類からの単一繊維の分離を示しています。同定されたMHC IおよびIIファイバーサンプルは、ウェスタンブロッティングを使用して、タンパク質発現におけるファイバータイプ特異的な違いについてさらに分析することができます。
Abstract
ここで説明する技術は、ドットブロッティング(以下、筋線維タイプのIDエンティフィケーション(MyDoBID)のためのDot BロッティングによるMyosin重鎖検出と呼ぶドットブロッティングを用いて、個々の筋線維のセグメント中の特定のミオシン重鎖(MHC)アイソフォームを同定するために用いることができる。このプロトコルは人間の骨格筋を凍結乾燥し、単一の筋繊維の区分を隔離するプロセスを記述する。MyDoBIDを用いて、I型線維とII型線維をそれぞれMHCI特異的抗体とIIa特異的抗体で分類します。次に、分類されたファイバーは、各生検のファイバータイプ固有のサンプルに結合されます。
各サンプル中の総タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびUV活性化ゲル技術によって決定されます。ファイバータイプのサンプルは、ウェスタンブロッティングを使用して検証されます。また、複数のウェスタンブロットで標的タンパク質の検出を強化するために、タンパク質ローディングの正規化を行うことの重要性についても説明します。単繊維ウェスタンブロットと比較して、分類された繊維を繊維タイプ固有のサンプルに統合する利点には、サンプルの多様性、サンプルスループットの向上、投資時間の短縮、コスト削減対策などがあり、均質化された筋肉サンプルでは見落とされがちな繊維タイプ固有の貴重な情報を保持します。プロトコルの目的は、凍結乾燥したヒト骨格筋サンプルから単離されたタイプIおよびタイプII繊維の正確かつ効率的な同定を達成することです。
その後、これらの個々の繊維を組み合わせて、タイプIおよびタイプIIの繊維タイプ固有のサンプルを作成します。さらに、MHCIおよびMHCIIaが陰性であった線維のマーカーとしてアクチンを使用し、ウェスタンブロッティングによってIIx線維として確認されたIIx型線維の同定を含むようにプロトコルを拡張しています。次に、各繊維タイプ固有のサンプルを使用して、ウェスタンブロッティング技術を使用してさまざまな標的タンパク質の発現を定量化します。
Introduction
骨格筋は不均一な組織であり、細胞(繊維)が遅筋(タイプI)か速筋(タイプII)かに依存する明確な細胞代謝および収縮特性を持っています。繊維の種類は、収縮時間、短縮速度、耐疲労性など、いくつかの点で互いに異なるミオシン重鎖(MHC)アイソフォームを調べることで識別できます1。主なMHCアイソフォームには、I型、IIa型、IIb型、IIx型があり、それらの代謝プロファイルは酸化性(I型およびIIa型)または解糖系(IIx、IIb)のいずれかです1。これらの繊維の種類の割合は、筋肉の種類や種によって異なります。IIb型はげっ歯類の筋肉に広く見られます。ヒトの筋肉にはIIb型線維は含まれておらず、主にMHCアイソフォームI型およびIIa線維で構成されており、IIx線維の割合はわずかです2。タンパク質の発現プロファイルは繊維の種類によって異なり、加齢3、運動4,5、疾患6によって変化する可能性があります。
異なる骨格筋線維タイプの細胞応答を測定することは、筋ホモジネート(すべての線維タイプの混合物)の検査のために見落とされたり、不可能になったりすることがよくあります。単繊維ウェスタンブロットは、個々の筋線維中の複数のタンパク質の調査を可能にします7。この方法論は、ホモジネート調製物では得られなかった新規で有益な単繊維特性を生み出すために以前に利用されてきました。しかし、当初のシングルファイバーウェスタンブロット法には、時間がかかること、サンプルの複製ができないこと、高価で高感度な化学発光(ECL)試薬の使用など、いくつかの限界がありました。新鮮な組織を使用する場合、この方法は、限られた時間枠(すなわち、1〜2時間)内に個々の繊維を単離する必要があるという時間的制約のためにさらに制限されます。幸いなことに、この拘束は、凍結乾燥組織から単線維セグメントを単離することによって緩和される8。ただし、凍結乾燥サンプルからの繊維収集は、生検組織のサイズと品質によって制限されます。
ドットブロッティング法9を用いた繊維タイプの同定は、この包括的なプロトコルにおいて大幅に精緻化され、拡張された。以前、わずか2~10mgの湿潤重量の筋肉組織が凍結乾燥および単繊維MHCアイソフォームタンパク質分析に十分であることが実証されています9。Christensen et al.9 は、ドットブロッティングによって存在する MHC アイソフォームを検出するために、~1 mm のファイバーセグメントの 30% を使用し、これはウェスタンブロッティングによって確認されました。この研究では、ウェスタンブロッティングをドットブロッティングに置き換えることで、全体的なコストが~40倍削減されることが示されました(ファイバーセグメント50個分)。その後、繊維をタイプIおよびタイプIIのサンプルに「プール」し、実験的な複製を可能にした9。それにもかかわらず、限界は、タイプI(MHCI陽性)とタイプII(MHCII陽性繊維)の2つの繊維タイプ固有のサンプルしか得られず、タイプIIサンプルにはMHCIIaとMHCIIxの混合物が含まれていることでした6,10。特に、現在のプロトコルは、純粋なIIx型ファイバーの同定方法を示しており、一般的なプロトコルの問題に対するトラブルシューティング戦略を含む、非常に詳細なワークフロー(図1に要約)を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
繊維の収集
数年の経験に基づいて、ほとんどの研究者はこの手法を習得できます。しかし、実践することで、下流分析のためのファイバー収集をより迅速かつ効率的に行うことができます。プーリング用に品質の 30 本の単一ファイバーセグメントを分離できるようにするには、サンプルごとに 50 本のファイバーセグメントを収集することをお勧めします。妥当な基準を達成?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究で使用したMHC I(A4.840)およびMHCIIa(A4.74)に対する抗体は、H.M.Blau博士によって開発され、MHCIIx(6H1)に対する抗体は、C.A.ルーカス博士によって開発され、国立成育医療研究所の後援により、アイオワ大学によって維持されているDevelopmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)から入手しました。 生物科学部(アイオワ州アイオワシティ)。この研究のためにヒトの筋肉サンプルを提供してくれたVictoria L. Wyckelsmaに感謝します。図 1 の画像の大部分は、BioRender.com から入手したものです。
融資：
この研究は外部資金を受けていない。
Materials
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
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