Identificazione del tipo di fibra del muscolo scheletrico umano
Summary
Questo protocollo dimostra l’isolamento di una singola fibra dal muscolo scheletrico umano liofilizzato e la classificazione del tipo di fibra in base all’isoforma della catena pesante della miosina (MHC) utilizzando la tecnica del dot blotting. I campioni di fibre MHC I e II identificati possono quindi essere ulteriormente analizzati per le differenze specifiche del tipo di fibra nell’espressione proteica utilizzando il western blotting.
Abstract
La tecnica qui descritta può essere utilizzata per identificare specifiche isoforme della catena pesante della miosina (MHC) in segmenti di singole fibre muscolari utilizzando il dot blotting, di seguito denominato rilevamento della catena pesante della miaosina mediante lotto Dot Bper l’entificazione IDdel tipo di fibra muscolare (MyDoBID). Questo protocollo descrive il processo di liofilizzazione del muscolo scheletrico umano e l’isolamento di segmenti di singole fibre muscolari. Utilizzando MyDoBID, le fibre di tipo I e II sono classificate rispettivamente con anticorpi specifici per MHCI e IIa. Le fibre classificate vengono quindi combinate in campioni specifici per ogni biopsia.
La proteina totale in ciascun campione è determinata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil-solfato (SDS-PAGE) e tecnologia gel attivata dai raggi UV. Il tipo di fibra dei campioni viene convalidato utilizzando il western blotting. Viene inoltre descritta l’importanza di eseguire la normalizzazione del carico proteico per migliorare il rilevamento della proteina bersaglio in più western blot. I vantaggi del consolidamento delle fibre classificate in campioni specifici per il tipo di fibra rispetto ai western blot a fibra singola includono la versatilità del campione, l’aumento della produttività del campione, l’investimento di tempo più breve e le misure di risparmio sui costi, il tutto mantenendo preziose informazioni specifiche sul tipo di fibra che vengono spesso trascurate utilizzando campioni muscolari omogeneizzati. Lo scopo del protocollo è quello di ottenere un’identificazione accurata ed efficiente delle fibre di tipo I e di tipo II isolate da campioni di muscolo scheletrico umano liofilizzato.
Queste singole fibre vengono successivamente combinate per creare campioni specifici per il tipo di fibra di tipo I e di tipo II. Inoltre, il protocollo è stato esteso per includere l’identificazione delle fibre di tipo IIx, utilizzando l’actina come marcatore per le fibre che erano negative per MHCI e MHCIIa, che sono confermate come fibre IIx mediante western blotting. Ogni campione specifico per tipo di fibra viene quindi utilizzato per quantificare l’espressione di varie proteine bersaglio utilizzando tecniche di western blotting.
Introduction
Il muscolo scheletrico è un tessuto eterogeneo, con distinte proprietà cellulari, metaboliche e contrattili che dipendono dal fatto che la cellula (fibra) sia a contrazione lenta (tipo I) o a contrazione rapida (tipo II). Il tipo di fibra può essere identificato esaminando le isoforme della catena pesante della miosina (MHC), che differiscono l’una dall’altra in diversi modi, tra cui il tempo di contrazione, la velocità di accorciamento e la resistenza alla fatica1. Le principali isoforme MHC includono il tipo I, il tipo IIa, il tipo IIb e il tipo IIx e i loro profili metabolici sono ossidativi (tipo I e IIa) o glicolitici (IIx, IIb)1. La proporzione di questi tipi di fibre varia nel tipo di muscolo e tra le specie. Il tipo IIb è ampiamente presente nel muscolo dei roditori. I muscoli umani non contengono fibre di tipo IIb e sono costituiti prevalentemente da fibre isoforme MHC di tipo I e IIa, con una piccola percentuale di fibre IIx2. I profili di espressione proteica variano tra i diversi tipi di fibre e possono essere alterati con l’invecchiamento3, l’esercizio fisico 4,5 e la malattia6.
La misurazione delle risposte cellulari in diversi tipi di fibre muscolari scheletriche è spesso trascurata o non è possibile a causa dell’esame degli omogenati muscolari (un mix di tutti i tipi di fibre). Il western blot a fibra singola consente l’indagine di più proteine nelle singole fibre muscolari7. Questa metodologia è stata precedentemente utilizzata per produrre caratteristiche nuove e informative della singola fibra che non era possibile ottenere utilizzando preparati omogeneizzati. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni della metodologia originale del western blot a fibra singola, tra cui la natura dispendiosa in termini di tempo, l’incapacità di generare repliche del campione e l’uso di reagenti a chemiluminescenza potenziata (ECL) costosi e sensibili. Se si utilizza tessuto fresco, questo metodo è ulteriormente limitato a causa dei vincoli di tempo dovuti alla necessità di isolare le singole fibre entro un periodo di tempo limitato (ad esempio, 1-2 ore). Fortunatamente, questa restrizione è mitigata isolando segmenti di fibra singola dal tessuto liofilizzato8. Tuttavia, la raccolta di fibre da campioni liofilizzati è limitata dalle dimensioni e dalla qualità del tessuto sottoposto a biopsia.
L’identificazione del tipo di fibra utilizzando il metodo del dot blotting9 è stata significativamente elaborata e ampliata in questo protocollo completo. In precedenza, è stato dimostrato che un minimo di ~2-10 mg di tessuto muscolare umido è adeguato per la liofilizzazione e l’analisi della proteina isoforma MHC a fibra singola9. Christensen et al.9 hanno utilizzato il 30% di un segmento di fibra di ~1 mm per rilevare l’isoforma MHC presente mediante dot blotting, che è stata confermata dal western blotting. Questo lavoro ha dimostrato che sostituendo il western blotting con il dot blotting, i costi complessivi sono stati ridotti di ~ 40 volte (per 50 segmenti di fibra). Le fibre sono state poi “raggruppate” in campioni di tipo I e di tipo II, che hanno permesso la replicazione sperimentale9. Tuttavia, una limitazione è stata che sono stati ottenuti solo due campioni specifici per tipo di fibra: di tipo I (MHCI positivo) e di tipo II (fibre MHCII positive), con campioni di tipo II contenenti una miscela di MHCIIa e MHCIIx 6,10. In particolare, il protocollo corrente dimostra come è possibile identificare le fibre pure di tipo IIx e fornisce un flusso di lavoro altamente dettagliato (riepilogato nella Figura 1), comprese le strategie di risoluzione dei problemi comuni del protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Raccolta fibre
Sulla base di diversi anni di esperienza, la maggior parte dei ricercatori è in grado di padroneggiare questa tecnica; Tuttavia, la pratica porta a una raccolta più rapida ed efficiente delle fibre per le analisi a valle. Per essere in grado di isolare 30 segmenti di fibra singola di una qualità per il pooling, si consiglia di raccogliere 50 segmenti di fibra per campione. Si consiglia di studiare attentamente il video di raccolta delle fibre e dopo aver eseguito due sessioni di prat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli anticorpi contro MHC I (A4.840) e MHCIIa (A4.74) utilizzati in questo studio sono stati sviluppati dal Dr. H. M. Blau e l’anticorpo contro MHCIIx (6H1) è stato sviluppato dal Dr. C. A. Lucas e ottenuto dalla Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), grazie agli auspici del National Institute of Child Health and Human Development e mantenuto dall’Università dell’Iowa. Dipartimento di Scienze Biologiche (Iowa City, IA). Ringraziamo Victoria L. Wyckelsma per aver fornito i campioni di muscolo umano per questo studio. La maggior parte delle immagini nella Figura 1 proviene da BioRender.com.
Finanziamento:
Questo studio non ha ricevuto finanziamenti esterni.
Materials
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
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