Identifizierung des Fasertyps der menschlichen Skelettmuskulatur
Summary
Dieses Protokoll demonstriert die Einzelfaserisolierung aus gefriergetrocknetem menschlichem Skelettmuskel und die Klassifizierung von Fasertypen gemäß der Myosin-Schwerketten-Isoform (MHC) unter Verwendung der Dot-Blotting-Technik. Identifizierte MHC I- und II-Faserproben können dann mittels Western Blot weiter auf fasertypspezifische Unterschiede in der Proteinexpression analysiert werden.
Abstract
Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, um spezifische Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) in Segmenten einzelner Muskelfasern unter Verwendung von Dot-Blotting zu identifizieren, im Folgenden als My-Osin-Schwerketten-Detektion durch Do-t-B-Lotting zur Identifizierungdes Muskelfasertyps (MyDoBID) bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Gefriertrocknung der menschlichen Skelettmuskulatur und der Isolierung von Segmenten einzelner Muskelfasern. Mit MyDoBID werden Typ-I- und Typ-II-Fasern mit MHCI- bzw. IIa-spezifischen Antikörpern klassifiziert. Klassifizierte Fasern werden dann für jede Biopsie zu fasertypspezifischen Proben kombiniert.
Das Gesamtprotein in jeder Probe wird durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und UV-aktivierte Geltechnologie bestimmt. Der Fasertyp der Proben wird mittels Western Blot validiert. Es wird auch beschrieben, wie wichtig es ist, eine Normalisierung der Proteinbeladung durchzuführen, um die Detektion von Zielproteinen über mehrere Western Blots hinweg zu verbessern. Zu den Vorteilen der Konsolidierung klassifizierter Fasern in fasertypspezifischen Proben im Vergleich zu Western Blots mit einer Faser gehören die Vielseitigkeit der Proben, der erhöhte Probendurchsatz, die kürzere Zeitinvestition und die Kosteneinsparungsmaßnahmen, während wertvolle fasertypspezifische Informationen erhalten bleiben, die bei homogenisierten Muskelproben häufig übersehen werden. Der Zweck des Protokolls besteht darin, eine genaue und effiziente Identifizierung von Typ-I- und Typ-II-Fasern zu erreichen, die aus gefriergetrockneten menschlichen Skelettmuskelproben isoliert wurden.
Diese einzelnen Fasern werden anschließend zu typ- und typ-II-fasertypspezifischen Proben kombiniert. Darüber hinaus wird das Protokoll um die Identifizierung von Typ-IIx-Fasern erweitert, wobei Aktin als Marker für Fasern verwendet wird, die negativ für MHCI und MHCIIa waren, die durch Western Blot als IIx-Fasern bestätigt werden. Jede fasertypspezifische Probe wird dann verwendet, um die Expression verschiedener Zielproteine mit Hilfe von Western-Blotting-Techniken zu quantifizieren.
Introduction
Der Skelettmuskel ist ein heterogenes Gewebe mit ausgeprägten zellulären metabolischen und kontraktilen Eigenschaften, die davon abhängen, ob die Zelle (Faser) langsam zuckt (Typ I) oder schnell zuckt (Typ II). Der Fasertyp kann durch die Untersuchung der Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) identifiziert werden, die sich in mehrfacher Hinsicht voneinander unterscheiden, einschließlich Kontraktionszeit, Verkürzungsgeschwindigkeit und Ermüdungsbeständigkeit1. Zu den wichtigsten MHC-Isoformen gehören Typ I, Typ IIa, Typ IIb und Typ IIx, und ihre metabolischen Profile sind entweder oxidativ (Typ I und IIa) oder glykolytisch (IIx, IIb)1. Der Anteil dieser Fasertypen variiert je nach Muskeltyp und zwischen den Arten. Typ IIb kommt häufig im Nagetiermuskel vor. Menschliche Muskeln enthalten keine Typ-IIb-Fasern und bestehen überwiegend aus MHC-Isoformen der Typ-I- und IIa-Fasern, mit einem geringen Anteil an IIx-Fasern2. Die Proteinexpressionsprofile variieren zwischen verschiedenen Fasertypen und können sich mit dem Alter3, der körperlichen Betätigung 4,5 und der Krankheit6 verändern.
Die Messung zellulärer Reaktionen in verschiedenen Skelettmuskelfasertypen wird aufgrund der Untersuchung von Muskelhomogenaten (eine Mischung aus allen Fasertypen) oft übersehen oder ist nicht möglich. Der Western Blot mit einer Faser ermöglicht die Untersuchung mehrerer Proteine in einzelnen Muskelfasern7. Diese Methodik wurde zuvor verwendet, um neuartige und informative Einzelfasereigenschaften herzustellen, die mit Homogenatpräparaten nicht erreicht werden konnten. Es gibt jedoch einige Einschränkungen der ursprünglichen Einzelfaser-Western-Blot-Methode, einschließlich der zeitaufwändigen Natur, der Unfähigkeit, Probenreplikate zu erstellen, und der Verwendung teurer, empfindlicher Reagenzien für die verbesserte Chemilumineszenz (ECL). Wenn frisches Gewebe verwendet wird, ist diese Methode aufgrund der zeitlichen Beschränkungen, einzelne Fasern innerhalb eines begrenzten Zeitrahmens (d. h. 1-2 Stunden) zu isolieren, weiter eingeschränkt. Glücklicherweise wird diese Einschränkung durch die Isolierung von Einzelfasersegmenten aus gefriergetrocknetem Gewebe gemildert8. Die Fasergewinnung aus gefriergetrockneten Proben ist jedoch durch die Größe und Qualität des biopsierten Gewebes begrenzt.
Die Identifizierung von Fasertypen mit der Dot-Blotting-Methode9 wurde in diesem umfassenden Protokoll erheblich ausgearbeitet und erweitert. Zuvor wurde gezeigt, dass bereits ~2-10 mg nasses Muskelgewebe für die Gefriertrocknung und die Analyse von MHC-Isoformproteinen aus einer Faser ausreichen9. Christensen et al.9 verwendeten 30% eines ~1 mm großen Fasersegments, um die MHC-Isoform durch Dot Blot zu detektieren, was durch Western Blot bestätigt wurde. Diese Arbeit zeigte, dass durch die Substitution von Western Blotting durch Dot Blot die Gesamtkosten um ~40-fach gesenkt wurden (für 50 Fasersegmente). Die Fasern wurden dann in Typ-I- und Typ-II-Proben “gepoolt”, was eine experimentelle Replikation ermöglichte9. Eine Einschränkung bestand jedoch darin, dass nur zwei fasertypspezifische Proben gewonnen wurden: Typ I (MHCI-positiv) und Typ II (MHCII-positive Fasern), wobei Typ-II-Proben eine Mischung aus MHCIIa und MHCIIx 6,10 enthielten. Insbesondere zeigt das aktuelle Protokoll, wie reine Typ-IIx-Fasern identifiziert werden können, und bietet einen sehr detaillierten Arbeitsablauf (zusammengefasst in Abbildung 1), einschließlich Strategien zur Fehlerbehebung bei häufigen Protokollproblemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammlung von Fasern
Basierend auf mehrjähriger Erfahrung können die meisten Forscher diese Technik beherrschen; Die Praxis führt jedoch zu einer schnelleren und effizienteren Fasersammlung für nachgelagerte Analysen. Um 30 einzelne Fasersegmente einer Qualität für das Pooling isolieren zu können, wird empfohlen, 50 Fasersegmente pro Probe zu sammeln. Es wird empfohlen, das Video zur Fasersammlung sorgfältig und nach Durchführung von zwei Übungssitzungen (~50 Fasern pro Sitzung) zu studieren,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Studie verwendeten Antikörper gegen MHC I (A4.840) und MHCIIa (A4.74) wurden von Dr. H. M. Blau entwickelt, und der Antikörper gegen MHCIIx (6H1) wurde von Dr. C. A. Lucas entwickelt und von der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) unter der Schirmherrschaft des National Institute of Child Health and Human Development bezogen und von der University of Iowa unterhalten. Fachbereich Biologische Wissenschaften (Iowa City, IA). Wir danken Victoria L. Wyckelsma für die Bereitstellung der menschlichen Muskelproben für diese Studie. Der Großteil der Bilder in Abbildung 1 stammt aus BioRender.com.
Finanzierung:
Diese Studie erhielt keine Drittmittel.
Materials
| 1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
| 3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
| Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
| Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
| Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
| Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
| Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
| BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
| Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
| Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
| Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
| Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
| Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
| Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
| Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
| Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
| Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
| Grey lead pencil | N/A | N/A | |
| Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
| Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
| Lamp | N/A | N/A | |
| Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
| Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
| Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
| Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
| Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
| Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
| Petri dish lid | N/A | N/A | |
| Plastic tweezers | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
| Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
| PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
| Rocker | N/A | N/A | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Scissors | N/A | N/A | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
| Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
| Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
| Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |
References
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
- Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
- Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
- Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
- Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
- Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
- Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
- Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
- Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
- Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
- Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
- Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
- Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
- Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
