Uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis
Summary
Aquí describimos los protocolos para tres tipos de cultivos de explantes de piel embrionaria aviar que se pueden utilizar para examinar las interacciones de los tejidos, la película de lapso de tiempo de imágenes 4D (3D más tiempo), la perturbación global o local de la función molecular y la caracterización de la biología de sistemas.
Abstract
El desarrollo de la piel aviar durante la embriogénesis es un modelo único que puede proporcionar información valiosa sobre el patrón de los tejidos. Aquí se describen tres variaciones de los cultivos de explantes cutáneos para examinar diferentes aspectos del desarrollo de la piel. En primer lugar, los cultivos y manipulaciones de órganos ex vivo ofrecen a los investigadores la oportunidad de observar y estudiar directamente el desarrollo de las yemas de las plumas. El cultivo de explantes de piel puede crecer durante 7 días, lo que permite el análisis directo del comportamiento celular y la obtención de imágenes 4D a intervalos durante este período de crecimiento. Esto también permite manipulaciones físicas y moleculares de las condiciones de cultivo para visualizar la respuesta de los tejidos. Por ejemplo, las cuentas recubiertas con factor de crecimiento se pueden aplicar localmente para inducir cambios en el patrón de las plumas en un área limitada. Alternativamente, la transducción viral puede administrarse globalmente en los medios de cultivo para aumentar o disminuir la expresión génica. En segundo lugar, el protocolo de recombinación de piel permite a los investigadores investigar las interacciones de los tejidos entre la epidermis y el mesénquima que se derivan de diferentes regiones de la piel, diferentes etapas de la vida o diferentes especies. Esto brinda la oportunidad de probar la ventana de tiempo en la que el epitelio es competente para responder a las señales y su capacidad para formar diferentes apéndices de la piel en respuesta a señales de diferentes fuentes mesenquimales. En tercer lugar, la reconstitución de la piel mediante el uso de células dérmicas disociadas superpuestas con epitelio intacto restablece el desarrollo de la piel y permite el estudio de los procesos iniciales de patrones periódicos. Este enfoque también mejora nuestra capacidad para manipular la expresión génica entre las células disociadas antes de crear el explante de piel reconstituido. Este artículo proporciona los tres protocolos de cultivo y experimentos ejemplares para demostrar su utilidad.
Introduction
El desarrollo de la piel del embrión aviar es un excelente modelo para estudiar los mecanismos de morfogénesis debido a los distintos patrones y la accesibilidad a la microcirugía y la manipulación 1,2. Sin embargo, la evaluación de eventos celulares y moleculares en tejidos intactos puede ser difícil porque la presencia de tejidos extraños puede complicar las observaciones microscópicas. Además, la capacidad de manipular la expresión génica para probar su papel en la morfogénesis de la piel no siempre es una tarea sencilla. Descubrimos que podemos probar las funciones de los genes mediante la transducción retroviral con una mayor tasa de éxito utilizando modelos de explantes de piel. Aquí discutimos las ventajas de tres modelos de explantes de piel que se han desarrollado.
El cultivo de piel embrionaria aviar es un poderoso sistema para evaluar el comportamiento celular, la regulación génica y la función durante el desarrollo de las yemas de las plumas de la piel 3,4,5,6. Permite la evaluación de los mecanismos moleculares del desarrollo de las yemas de las plumas a través de la adición global de factores de crecimiento colocados en los medios de cultivo o su liberación local a partir de perlas recubiertas de factores de crecimiento. Los genes reguladores del desarrollo también pueden manipularse utilizando la transducción de genes virales de formas negativas intactas o dominantes para estudios funcionales que evalúan su papel en eventos morfogenéticos específicos 7,8.
El cultivo de recombinación epitelio-mesenquimal aviar permite a los investigadores determinar las contribuciones de cada componente de la piel durante las primeras etapas de la morfogénesis de la piel. El uso de este enfoque por parte de Rawles reveló que las interacciones entre el mesénquima y el epitelio son esenciales para la formación de apéndicescutáneos 9. El mesénquima puede formar condensaciones y el epitelio es necesario para inducir y mantener las formaciones de condensación mesenquimal2. Más tarde, este enfoque se utilizó para evaluar por qué los pollos sin escamas no logran formar plumas. Se descubrió que el defecto estaba en el mesénquima10. Dhouailly realizó estudios de recombinación epitelio-mesenquimal tisular en embriones de diferentes especies. Estos estudios proporcionaron información sobre el desarrollo y la evolución de las comunicaciones epitelio-mesenquimales que promueven la morfogénesis de la piel3.
Este estudio se utilizó para comprender mejor los factores que controlan el crecimiento de las plumas. El método también mejora la visualización de los eventos celulares y moleculares involucrados en el modelado de la piel que tienen lugar durante la iniciación, el desarrollo y el alargamiento de las plumas a lo largo del eje antero-posterior. Cuando el epitelio se separa del mesénquima y los dos componentes se recombinan, las nuevas interacciones restablecen el patrón de la piel. Este enfoque nos permite evaluar las señales inductoras mesenquimales y las moléculas de competencia epitelial que permiten a la epidermis responder a las señales mesenquimales11. También se puede examinar la expresión molecular posterior que se requiere para el desarrollo de las yemas de las plumas y la formación de patrones. Estos estudios han establecido que la ubicación de las yemas está controlada por el mesénquima. La rotación del epitelio 90o antes de la recombinación con el mesénquima demuestra que la dirección de la elongación de la yema de la pluma está controlada por el epitelio. Este método fue esencial para estudiar el mecanismo molecular que regula la orientación de las yemas de las plumas12.
El cultivo de reconstitución de la piel aviar, en el que el mesénquima de la piel se disocia en células individuales antes de la siembra a alta densidad celular y se superpone con epitelio intacto, restablece las células dérmicas a un estado primordial. A continuación, el explante se autoorganiza para formar un nuevo patrón periódico independiente de las señales anteriores13. Este modelo de reconstitución de la piel se puede utilizar para estudiar los procesos iniciales del patrón periódico de las plumas. Utilizamos este enfoque para explorar cómo la modulación de la proporción de células mesenquimales por una sola pieza de epitelio puede influir en el tamaño o el número de yemas de plumas. Se encontró que el número de yemas aumentaba, pero no el tamaño de las yemas, ya que aumentaba la proporción de células mesenquimales. Otra ventaja de este enfoque es que la transducción viral de células mesenquimales muestra una mayor eficiencia que en las otras dos condiciones de cultivo y puede producir fenotipos más obvios.
Protocol
Representative Results
Discussion
La recombinación de tejidos proporciona un ensayo para explorar las contribuciones únicas del epitelio y el mesénquima. En los pollos, las plumas comienzan a desarrollarse en el día embrionario 7 (E7), mientras que las escamas comienzan en E9. Cuando el mesénquima de escamas E9 se recombina con el epitelio de las plumas E7, el tejido recombinado forma escamas, y cuando el mesénquima de las plumas E7 se recombina con el epitelio de las escamas E9, se forman plumas11. Estos estudios han demost…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de las subvenciones R37 AR 060306, R01 AR 047364 y RO1 AR078050 de los NIAMS. El trabajo también está respaldado por un contrato de investigación colaborativa entre la USC y la Universidad Médica de China en Taiwán. Agradecemos a la clase USC BISC 480 Developmental Biology 2023 por probar con éxito este protocolo de cultivo de piel aviar durante varios módulos de laboratorio.
Materials
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, (1972).
- Sengel, P. . In Morphogenesis of Skin, l-277. , (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, . Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -. X., Noveen, A., Chen, C. -. W. J., Chuong, C. -. M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -. M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
