Использование эксплантов птичьей кожи для изучения структуры тканей и органогенеза
Summary
Здесь мы описываем протоколы для трех типов культур эксплантации кожи эмбрионов птиц, которые могут быть использованы для изучения тканевых взаимодействий, 4D-визуализации таймлапс-пленки (3D плюс время), глобальных или локальных возмущений молекулярной функции и характеристик системной биологии.
Abstract
Развивающаяся птичья кожа во время эмбриогенеза является уникальной моделью, которая может дать ценную информацию о структуре тканей. Здесь описаны три вариации культур эксплантов кожи для изучения различных аспектов развития кожи. Во-первых, культивирование органов ex vivo и манипуляции с ними дают исследователям возможность наблюдать и изучать развитие перьевых почек напрямую. Культура кожных эксплантов может расти в течение 7 дней, что позволяет проводить прямой анализ клеточного поведения и получать 4D-визуализацию с интервалами в течение этого периода роста. Это также позволяет проводить физические и молекулярные манипуляции с условиями культивирования для визуализации реакции тканей. Например, бусины, покрытые фактором роста, могут наноситься локально, чтобы вызвать изменения в рисунке перьев на ограниченной площади. В качестве альтернативы, вирусная трансдукция может быть доставлена глобально в питательных средах для повышения или понижения экспрессии генов. Во-вторых, протокол рекомбинации кожи позволяет исследователям исследовать тканевые взаимодействия между эпидермисом и мезенхимой, которые происходят из разных областей кожи, разных этапов жизни или разных видов. Это дает возможность проверить временное окно, в течение которого эпителий способен реагировать на сигналы, и его способность формировать различные придатки кожи в ответ на сигналы от различных мезенхимальных источников. В-третьих, восстановление кожи с использованием диссоциированных дермальных клеток, покрытых интактным эпителием, обнуляет развитие кожи и позволяет изучить начальные процессы периодического формирования паттернов. Этот подход также расширяет наши возможности по манипулированию экспрессией генов среди диссоциированных клеток перед созданием восстановленного кожного экспланта. В этой статье представлены три протокола культивирования и примеры экспериментов, демонстрирующие их полезность.
Introduction
Развитие кожи птичьего эмбриона является отличной моделью для изучения механизмов морфогенеза из-за его особенностей и доступности к микрохирургии и манипуляциям 1,2. Тем не менее, оценка клеточных и молекулярных событий в интактных тканях может быть затруднена, потому что присутствие посторонних тканей может усложнить микроскопические наблюдения. Кроме того, способность манипулировать экспрессией генов для проверки их роли в морфогенезе кожи не всегда является простой задачей. Мы обнаружили, что можем проверить функции генов с помощью ретровирусной трансдукции с более высоким уровнем успеха на моделях эксплантов кожи. В этой статье мы обсудим преимущества трех разработанных моделей эксплантов кожи.
Культура эмбриональной кожи птиц является мощной системой для оценки поведения клеток, регуляции генов и функций во время развития перьевых почек кожи 3,4,5,6. Это позволяет оценить молекулярные механизмы развития перьевых почек за счет глобального добавления факторов роста, помещенных в питательные среды, или их локального высвобождения из гранул, покрытых факторами роста. Регуляторные гены развития также могут быть манипулированы с помощью вирусной трансдукции интактных или доминантных негативных форм для функциональных исследований, оценивая их роль в конкретных морфогенетических событиях 7,8.
Культура эпителиально-мезенхимальной рекомбинации птиц позволяет исследователям определить вклад каждого компонента кожи на ранних стадиях морфогенеза кожи. Использование Роулзом этого подхода показало, что взаимодействие между мезенхимой и эпителием имеет важное значение для формирования придатков кожи9. Мезенхима может образовывать конденсации, а эпителий необходим для индукции и поддержания образования мезенхимальной конденсации2. Позже этот подход был использован для оценки того, почему бесчешуйчатые куры не могут формировать перья. Обнаружено, что дефект находится в мезенхиме10. Дуайи проводил исследования тканевой эпителиально-мезенхимальной рекомбинации у эмбрионов разных видов. Эти исследования позволили получить представление о развитии и эволюции эпителиально-мезенхимальных коммуникаций, которые способствуют морфогенезу кожи3.
Это исследование было использовано для лучшего понимания факторов, контролирующих рост перьев. Метод также улучшает визуализацию клеточных и молекулярных событий, участвующих в формировании кожного рисунка, которые происходят во время зарождения, развития и удлинения перьев вдоль передне-задней оси. Когда эпителий отделяется от мезенхимы и два компонента затем рекомбинируются, новые взаимодействия восстанавливают структуру кожи. Этот подход позволяет оценить мезенхимальные индуцирующие сигналы и молекулы эпителиальной компетентности, которые позволяют эпидермису реагировать на мезенхимальные сигналы11. Последующая молекулярная экспрессия, необходимая для развития перьевых почек и формирования узоров, также может быть изучена. Эти исследования установили, что расположение бутонов контролируется мезенхимой. Вращение эпителия на 90° до рекомбинации с мезенхимой показывает, что направление удлинения перьевого зачатка контролируется эпителием. Этот метод был необходим для изучения молекулярного механизма, регулирующего ориентацию перьевых почек12.
Культура восстановления птичьей кожи, в которой мезенхима кожи перед нанесением диссоциирована на отдельные клетки при высокой плотности клеток и покрыта неповрежденным эпителием, сбрасывает клетки дермы в исходное состояние. Затем эксплант самоорганизуется, образуя новый периодический паттерн, независимый от предыдущих сигналов13. Эта модель восстановления кожи может быть использована для изучения начальных процессов периодического формирования перьев. Мы использовали этот подход для изучения того, как модуляция соотношения мезенхимальных клеток к одному кусочку эпителия может влиять на размер или количество перьевых почек. Было обнаружено, что количество почек увеличивается, но не размер почек, поскольку соотношение мезенхимальных клеток увеличивается. Еще одним преимуществом этого подхода является то, что вирусная трансдукция мезенхимальных клеток показывает более высокую эффективность, чем в двух других условиях культивирования, и может продуцировать более очевидные фенотипы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рекомбинация тканей обеспечивает анализ для изучения уникального вклада эпителия и мезенхимы. У цыплят перья начинают развиваться на эмбриональный день 7 (Е7), в то время как чешуя начинается на Е9. Когда чешуйчатая мезенхима Е9 рекомбинируется с перьевым эпителием Е7, рекомбинированная …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддержана грантами NIH NIAMS R37 AR 060306, R01 AR 047364 и RO1 AR078050. Работа также поддерживается совместным исследовательским контрактом между Университетом Южной Калифорнии и Китайским медицинским университетом на Тайване. Мы благодарим класс USC BISC 480 Developmental Biology 2023 за успешное тестирование этого протокола культивирования птичьей кожи в течение нескольких лабораторных модулей.
Materials
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, (1972).
- Sengel, P. . In Morphogenesis of Skin, l-277. , (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, . Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -. X., Noveen, A., Chen, C. -. W. J., Chuong, C. -. M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -. M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
