Utilisation d’explants de peau aviaire pour étudier la structuration et l’organogenèse des tissus
Summary
Nous décrivons ici des protocoles pour trois types de cultures d’explants de peau embryonnaire aviaire qui peuvent être utilisés pour examiner les interactions tissulaires, le film timelapse d’imagerie 4D (3D plus temps), la perturbation globale ou locale de la fonction moléculaire et la caractérisation de la biologie des systèmes.
Abstract
Le développement de la peau aviaire au cours de l’embryogenèse est un modèle unique qui peut fournir des informations précieuses sur la structure des tissus. Ici, trois variations sur les cultures d’explants de peau pour examiner différents aspects du développement de la peau sont décrites. Tout d’abord, les cultures et les manipulations d’organes ex vivo offrent aux chercheurs la possibilité d’observer et d’étudier directement le développement des bourgeons de plumes. La culture d’explants de peau peut croître pendant 7 jours, ce qui permet une analyse directe du comportement cellulaire et l’imagerie 4D à intervalles réguliers pendant cette période de croissance. Cela permet également des manipulations physiques et moléculaires des conditions de culture pour visualiser la réponse tissulaire. Par exemple, des billes enrobées de facteur de croissance peuvent être appliquées localement pour induire des changements dans le motif des plumes dans une zone limitée. Alternativement, la transduction virale peut être administrée à l’échelle mondiale dans les milieux de culture pour réguler à la hausse ou à la baisse l’expression des gènes. Deuxièmement, le protocole de recombinaison cutanée permet aux chercheurs d’étudier les interactions tissulaires entre l’épiderme et le mésenchyme qui proviennent de différentes régions de la peau, de différents stades de vie ou de différentes espèces. Cela offre l’occasion de tester la fenêtre temporelle dans laquelle l’épithélium est capable de répondre aux signaux et sa capacité à former différents appendices cutanés en réponse à des signaux provenant de différentes sources mésenchymateuses. Troisièmement, la reconstitution de la peau à l’aide de cellules dermiques dissociées recouvertes d’un épithélium intact réinitialise le développement de la peau et permet d’étudier les processus initiaux de structuration périodique. Cette approche améliore également notre capacité à manipuler l’expression des gènes entre les cellules dissociées avant de créer l’explant de peau reconstituée. Cet article présente les trois protocoles de culture et des expériences exemplaires pour démontrer leur utilité.
Introduction
Le développement de la peau de l’embryon aviaire est un excellent modèle pour étudier les mécanismes de la morphogenèse en raison des motifs distincts et de l’accessibilité à la microchirurgie et à la manipulation 1,2. Cependant, l’évaluation des événements cellulaires et moléculaires dans les tissus intacts peut être difficile car la présence de tissus étrangers peut compliquer les observations microscopiques. De plus, la capacité de manipuler l’expression des gènes pour tester leur rôle dans la morphogenèse de la peau n’est pas toujours une tâche simple. Nous constatons que nous pouvons tester les fonctions des gènes en utilisant la transduction rétrovirale avec un taux de réussite plus élevé en utilisant des modèles d’explants de peau. Nous abordons ici les avantages de trois modèles d’explants de peau qui ont été développés.
La culture de peau embryonnaire aviaire est un système puissant pour évaluer le comportement cellulaire, la régulation des gènes et la fonction pendant le développement des bourgeons de plumes de la peau 3,4,5,6. Il permet d’évaluer les mécanismes moléculaires du développement des bourgeons de plumes par l’ajout global de facteurs de croissance placés dans le milieu de culture ou leur libération locale à partir de billes enrobées de facteurs de croissance. Les gènes régulateurs du développement peuvent également être manipulés à l’aide de la transduction de gènes viraux de formes négatives intactes ou dominantes pour des études fonctionnelles évaluant leurs rôles dans des événements morphogénétiques spécifiques 7,8.
La culture de recombinaison épithélio-mésenchymateuse aviaire permet aux chercheurs de déterminer les contributions de chaque composant de la peau au cours des premiers stades de la morphogenèse de la peau. L’utilisation de cette approche par Rawles a révélé que les interactions entre le mésenchyme et l’épithélium sont essentielles à la formation des appendices cutanés9. Le mésenchyme peut former des condensations et l’épithélium est nécessaire pour induire et maintenir les formations de condensation mésenchymateuse2. Plus tard, cette approche a été utilisée pour évaluer pourquoi les poulets sans écailles ne forment pas de plumes. On a découvert que le défaut se trouvait dans le mésenchyme10. Dhouailly a réalisé des études de recombinaison épithélio-mésenchymateuse tissulaire chez des embryons d’espèces différentes. Ces études ont fourni des informations développementales et évolutives sur les communications épithéliales-mésenchymateuses qui favorisent la morphogenèse de la peau3.
Cette étude a été utilisée pour mieux comprendre les facteurs qui contrôlent la croissance des plumes. La méthode améliore également la visualisation des événements cellulaires et moléculaires impliqués dans la structuration de la peau qui se produisent lors de l’initiation, du développement et de l’allongement des plumes le long de l’axe antéro-postérieur. Lorsque l’épithélium est séparé du mésenchyme et que les deux composants sont ensuite recombinés, de nouvelles interactions rétablissent le modelage de la peau. Cette approche nous permet d’évaluer les signaux inducteurs mésenchymateux et les molécules de compétence épithéliale qui permettent à l’épiderme de répondre aux signaux mésenchymateux11. L’expression moléculaire ultérieure en aval qui est nécessaire au développement des bourgeons de plumes et à la formation de motifs peut également être examinée. Ces études ont établi que l’emplacement des bourgeons est contrôlé par le mésenchyme. La rotation de l’épithélium de 90° avant la recombinaison avec le mésenchyme démontre que la direction de l’allongement du bourgeon de plume est contrôlée par l’épithélium. Cette méthode était essentielle pour nous permettre d’étudier le mécanisme moléculaire régulant l’orientation des bourgeons de plumes12.
La culture de reconstitution de la peau aviaire, dans laquelle le mésenchyme cutané est dissocié en cellules uniques avant d’être plaqué à haute densité cellulaire et recouvert d’un épithélium intact, réinitialise les cellules dermiques à un état primordial. L’explant s’auto-organise alors pour former un nouveau motif périodique indépendant des indices précédents13. Ce modèle de reconstitution cutanée peut être utilisé pour étudier les processus initiaux de la structuration périodique des plumes. Nous avons utilisé cette approche pour explorer comment la modulation du rapport entre les cellules mésenchymateuses et un seul morceau d’épithélium peut influencer la taille ou le nombre de bourgeons de plumes. On a constaté que le nombre de bourgeons augmentait, mais pas la taille des bourgeons, car le rapport des cellules mésenchymateuses augmentait. Un autre avantage de cette approche est que la transduction virale des cellules mésenchymateuses montre une efficacité plus élevée que dans les deux autres conditions de culture et peut produire des phénotypes plus évidents.
Protocol
Representative Results
Discussion
La recombinaison tissulaire permet d’explorer les contributions uniques de l’épithélium et du mésenchyme. Chez les poulets, les plumes commencent à se développer au jour embryonnaire 7 (E7) tandis que les écailles commencent à E9. Lorsque le mésenchyme de l’écaille E9 est recombiné avec l’épithélium de la plume E7, le tissu recombiné forme des écailles, et lorsque le mésenchyme de la plume E7 est recombiné avec l’épithélium de l’écaille E9, les plumes se forment11. C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par les subventions R37 AR 060306, R01 AR 047364 et RO1 AR078050 du NIAMS. Le travail est également soutenu par un contrat de recherche collaboratif entre l’USC et l’Université médicale de Chine à Taïwan. Nous remercions la classe USC BISC 480 Developmental Biology 2023 d’avoir testé avec succès ce protocole de culture de peau aviaire au cours de plusieurs modules de laboratoire.
Materials
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
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