Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti
Summary
Qui descriviamo i protocolli per tre tipi di colture di espianti di pelle embrionale aviaria che possono essere utilizzate per esaminare le interazioni tissutali, il filmato timelapse di imaging 4D (3D più tempo), la perturbazione globale o locale della funzione molecolare e la caratterizzazione della biologia dei sistemi.
Abstract
Lo sviluppo della pelle aviaria durante l’embriogenesi è un modello unico in grado di fornire preziose informazioni sulla modellazione dei tessuti. Qui vengono descritte tre variazioni sulle colture di espianti cutanei per esaminare diversi aspetti dello sviluppo cutaneo. In primo luogo, le colture e le manipolazioni di organi ex vivo offrono ai ricercatori l’opportunità di osservare e studiare direttamente lo sviluppo dei boccioli di piume. La coltura di espianti cutanei può crescere per 7 giorni, consentendo l’analisi diretta del comportamento cellulare e l’imaging 4D a intervalli durante questo periodo di crescita. Ciò consente anche manipolazioni fisiche e molecolari delle condizioni di coltura per visualizzare la risposta dei tessuti. Ad esempio, le perle rivestite con fattore di crescita possono essere applicate localmente per indurre cambiamenti nel disegno delle piume in un’area limitata. In alternativa, la trasduzione virale può essere somministrata a livello globale nei terreni di coltura per aumentare o diminuire l’espressione genica. In secondo luogo, il protocollo di ricombinazione cutanea consente ai ricercatori di studiare le interazioni tissutali tra l’epidermide e il mesenchima che derivano da diverse regioni della pelle, diverse fasi di vita o diverse specie. Ciò offre l’opportunità di testare la finestra temporale in cui l’epitelio è competente a rispondere ai segnali e la sua capacità di formare diverse appendici cutanee in risposta a segnali provenienti da diverse fonti mesenchimali. In terzo luogo, la ricostituzione della pelle utilizzando cellule dermiche dissociate sovrapposte a epitelio intatto ripristina lo sviluppo della pelle e consente lo studio dei processi iniziali di patterning periodico. Questo approccio migliora anche la nostra capacità di manipolare l’espressione genica tra le cellule dissociate prima di creare l’espiante cutaneo ricostituito. Questo documento fornisce i tre protocolli di coltura ed esperimenti esemplari per dimostrarne l’utilità.
Introduction
Lo sviluppo della pelle degli embrioni aviari è un modello eccellente per studiare i meccanismi della morfogenesi a causa dei modelli distinti e dell’accessibilità alla microchirurgia e alla manipolazione 1,2. Tuttavia, la valutazione degli eventi cellulari e molecolari nei tessuti intatti può essere difficile perché la presenza di tessuti estranei può complicare le osservazioni microscopiche. Inoltre, la capacità di manipolare l’espressione genica per testare il loro ruolo nella morfogenesi cutanea non è sempre un compito semplice. Scopriamo che possiamo testare le funzioni geniche utilizzando la trasduzione retrovirale con un tasso di successo più elevato utilizzando modelli di espianti cutanei. Qui discutiamo i vantaggi di tre modelli di espianti di pelle che sono stati sviluppati.
La coltura embrionale aviaria della pelle è un potente sistema per valutare il comportamento cellulare, la regolazione genica e la funzione durante lo sviluppo delle gemme delle piume della pelle 3,4,5,6. Consente di valutare i meccanismi molecolari dello sviluppo delle gemme di piume attraverso l’aggiunta globale di fattori di crescita posti nei terreni di coltura o il loro rilascio locale da perle rivestite di fattore di crescita. I geni regolatori dello sviluppo possono anche essere manipolati utilizzando la trasduzione genica virale di forme negative intatte o dominanti per studi funzionali che valutano il loro ruolo in specifici eventi morfogenetici 7,8.
La coltura di ricombinazione epiteliale-mesenchimale aviaria consente ai ricercatori di determinare i contributi di ciascun componente cutaneo durante le prime fasi della morfogenesi cutanea. L’uso di questo approccio da parte di Rawles ha rivelato che le interazioni tra il mesenchima e l’epitelio sono essenziali per la formazione delle appendici cutanee9. Il mesenchima può formare condensazioni e l’epitelio è necessario per indurre e mantenere le formazioni di condensazione mesenchimale2. Successivamente, questo approccio è stato utilizzato per valutare il motivo per cui i polli senza squame non riescono a formare piume. Si è scoperto che il difetto era nel mesenchima10. Dhouailly ha eseguito studi di ricombinazione epiteliale-mesenchimale tissutale in embrioni di specie diverse. Questi studi hanno fornito informazioni sullo sviluppo e sull’evoluzione delle comunicazioni epitelio-mesenchimali che promuovono la morfogenesi cutanea3.
Questo studio è stato utilizzato per comprendere meglio i fattori che controllano la crescita delle piume. Il metodo migliora anche la visualizzazione degli eventi cellulari e molecolari coinvolti nel patterning cutaneo che si verificano durante l’inizio, lo sviluppo e l’allungamento delle piume lungo l’asse antero-posteriore. Quando l’epitelio viene separato dal mesenchima e i due componenti vengono quindi ricombinati, nuove interazioni ristabiliscono il pattern cutaneo. Questo approccio ci permette di valutare i segnali induttori mesenchimali e le molecole di competenza epiteliale che consentono all’epidermide di rispondere ai segnali mesenchimali11. Può essere esaminata anche la successiva espressione molecolare a valle, necessaria per lo sviluppo delle gemme di piume e la formazione del modello. Questi studi hanno stabilito che la posizione delle gemme è controllata dal mesenchima. La rotazione dell’epitelio di 90o prima della ricombinazione con il mesenchima dimostra che la direzione dell’allungamento della gemma della piuma è controllata dall’epitelio. Questo metodo è stato essenziale per noi per studiare il meccanismo molecolare che regola l’orientamento delle gemme delle piume12.
La coltura di ricostituzione della pelle aviaria, in cui il mesenchima cutaneo viene dissociato da singole cellule prima di essere placcato ad alta densità cellulare e ricoperto da epitelio intatto, ripristina le cellule dermiche a uno stato primordiale. L’espianto quindi si auto-organizza per formare un nuovo modello periodico indipendente dai segnali precedenti13. Questo modello di ricostituzione della pelle può essere utilizzato per studiare i processi iniziali del pattern periodico delle piume. Abbiamo utilizzato questo approccio per esplorare come la modulazione del rapporto tra cellule mesenchimali e un singolo pezzo di epitelio possa influenzare la dimensione o il numero di gemme di piume. È stato riscontrato che il numero di gemme aumenta, ma non le dimensioni delle gemme all’aumentare del rapporto tra le cellule mesenchimali. Un altro vantaggio di questo approccio è che la trasduzione virale delle cellule mesenchimali mostra un’efficienza maggiore rispetto alle altre due condizioni di coltura e può produrre fenotipi più evidenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricombinazione tissutale fornisce un saggio per esplorare i contributi unici dell’epitelio e del mesenchima. Nei polli, le piume iniziano a svilupparsi al giorno embrionale 7 (E7) mentre le squame iniziano a E9. Quando il mesenchima della squama E9 viene ricombinato con l’epitelio della piuma E7, il tessuto ricombinato forma squame e quando il mesenchima della piuma E7 viene ricombinato con l’epitelio della squama E9 si formano11 penne. Questi studi hanno dimostrato che il mesenchima controlla …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione NIH NIAMS R37 AR 060306, R01 AR 047364 e RO1 AR078050. Il lavoro è anche supportato da un contratto di ricerca collaborativa tra l’USC e la China Medical University di Taiwan. Ringraziamo la classe USC BISC 480 Developmental Biology 2023 per aver testato con successo questo protocollo di coltura della pelle aviaria durante diversi moduli di laboratorio.
Materials
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
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