استخدام نباتات جلد الطيور لدراسة أنماط الأنسجة وتكوين الأعضاء
Summary
هنا نصف بروتوكولات لثلاثة أنواع من مزارع زرع الجلد الجنيني للطيور التي يمكن استخدامها لفحص تفاعلات الأنسجة ، وفيلم التصوير الفاصل الزمني 4D (3D plus time) ، والاضطراب العالمي أو المحلي للوظيفة الجزيئية ، وتوصيف بيولوجيا الأنظمة.
Abstract
يعد جلد الطيور النامي أثناء التطور الجنيني نموذجا فريدا يمكن أن يوفر رؤى قيمة حول أنماط الأنسجة. فيما يلي ثلاثة اختلافات في مزارع زراعة الجلد لفحص الجوانب المختلفة لنمو الجلد. أولا ، توفر ثقافات الأعضاء خارج الجسم الحي والتلاعب فرصا للباحثين لمراقبة ودراسة تطور براعم الريش مباشرة. يمكن أن تنمو زراعة الجلد لمدة 7 أيام مما يتيح التحليل المباشر للسلوك الخلوي والتصوير 4D على فترات خلال فترة النمو هذه. وهذا يسمح أيضا للتلاعب الفيزيائي والجزيئي لظروف الثقافة لتصور استجابة الأنسجة. على سبيل المثال ، يمكن تطبيق الخرز المطلي بعامل النمو محليا لإحداث تغييرات في نقوش الريش في منطقة محدودة. بدلا من ذلك ، يمكن توصيل النقل الفيروسي عالميا في وسائط الثقافة لزيادة أو تقليل التعبير الجيني. ثانيا ، يسمح بروتوكول إعادة تركيب الجلد للباحثين بالتحقيق في تفاعلات الأنسجة بين البشرة واللحمة المتوسطة المشتقة من مناطق الجلد المختلفة أو مراحل الحياة المختلفة أو الأنواع المختلفة. وهذا يتيح فرصة لاختبار النافذة الزمنية التي تكون فيها الظهارة مؤهلة للاستجابة للإشارات وقدرتها على تكوين زوائد جلدية مختلفة استجابة لإشارات من مصادر مختلفة للحمة المتوسطة. ثالثا ، إعادة تكوين الجلد باستخدام خلايا جلدية منفصلة مغطاة بظهارة سليمة تعيد نمو الجلد وتمكن من دراسة العمليات الأولية للأنماط الدورية. يعزز هذا النهج أيضا قدرتنا على التعامل مع التعبير الجيني بين الخلايا المنفصلة قبل إنشاء نبات الجلد المعاد تشكيله. تقدم هذه الورقة بروتوكولات الاستزراع الثلاثة والتجارب النموذجية لإثبات فائدتها.
Introduction
يعد تطور جلد جنين الطيور نموذجا ممتازا لدراسة آليات التشكل بسبب الأنماط المميزة وإمكانية الوصول إلى الجراحة المجهرية والتلاعب1،2. ومع ذلك ، قد يكون تقييم الأحداث الخلوية والجزيئية في الأنسجة السليمة أمرا صعبا لأن وجود الأنسجة الدخيلة يمكن أن يعقد الملاحظات المجهرية. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على التلاعب بالتعبير الجيني لاختبار دورها في تشكل الجلد ليست دائما مهمة بسيطة. نجد أنه يمكننا اختبار وظائف الجينات باستخدام نقل الفيروسات القهقرية بمعدل نجاح أعلى باستخدام نماذج زراعة الجلد. نناقش هنا مزايا ثلاثة نماذج لزرع الجلد تم تطويرها.
زراعة الجلد الجنيني للطيور هي نظام قوي لتقييم سلوك الخلية وتنظيم الجينات ووظيفتها أثناء تطور برعم ريشة الجلد3،4،5،6. يسمح بتقييم الآليات الجزيئية لتطور برعم الريش من خلال الإضافة العالمية لعوامل النمو الموضوعة في وسائط الاستزراع أو إطلاقها محليا من الخرز المطلي بعامل النمو. يمكن أيضا التلاعب بالجينات التنظيمية التنموية باستخدام نقل الجينات الفيروسية للأشكال السلبية السليمة أو السائدة للدراسات الوظيفية التي تقيم أدوارها في أحداث مورفوجينية محددة 7,8.
تمكن ثقافة إعادة التركيب الظهارية والوسيطة للطيور الباحثين من تحديد مساهمات كل مكون من مكونات الجلد خلال المراحل المبكرة من تشكل الجلد. كشف استخدام رولز لهذا النهج أن التفاعلات بين اللحمة المتوسطة والظهارة ضرورية لتشكيل الزوائدالجلدية 9. يمكن أن يشكل اللحمة المتوسطة تكاثفات وهناك حاجة إلى ظهارة للحث والحفاظ على تكوينات تكثيف اللحمةالمتوسطة 2. في وقت لاحق ، تم استخدام هذا النهج لتقييم سبب فشل الدجاج بلا قشور في تكوين الريش. تم اكتشاف أن العيب موجود في اللحمة المتوسطة10. أجرى Dhouailly دراسات إعادة التركيب الظهاري الوسيطة للأنسجة في أجنة من أنواع مختلفة. قدمت هذه الدراسات رؤى تنموية وتطورية في الاتصالات الظهارية المتوسطة التي تعزز تشكل الجلد3.
تم استخدام هذه الدراسة لفهم العوامل التي تتحكم في نمو الريش بشكل أفضل. تعمل الطريقة أيضا على تحسين تصور الأحداث الخلوية والجزيئية التي تنطوي عليها أنماط الجلد التي تحدث أثناء بدء الريش وتطوره واستطالته على طول المحور الأمامي الخلفي. عندما يتم فصل الظهارة عن اللحمة المتوسطة ثم يتم إعادة دمج المكونين ، فإن التفاعلات الجديدة تعيد تأسيس نمط الجلد. يسمح لنا هذا النهج بتقييم الإشارات المحفزة للحمة المتوسطة وجزيئات الكفاءة الظهارية التي تمكن البشرة من الاستجابة لإشارات اللحمة المتوسطة11. يمكن أيضا فحص التعبير الجزيئي اللاحق المطلوب لتطوير برعم الريش وتشكيل الأنماط. أثبتت هذه الدراسات أن موقع البراعم يتحكم فيه اللحمة المتوسطة. يوضح دوران الظهارة 90o قبل إعادة التركيب مع اللحمة المتوسطة أن اتجاه استطالة برعم الريش يتم التحكم فيه بواسطة الظهارة. كانت هذه الطريقة ضرورية بالنسبة لنا لدراسة الآلية الجزيئية التي تنظم اتجاه برعم الريش12.
ثقافة إعادة تكوين جلد الطيور ، حيث يتم فصل اللحمة المتوسطة للجلد إلى خلايا مفردة قبل الطلاء بكثافة عالية للخلايا وتغطيتها بظهارة سليمة ، تعيد الخلايا الجلدية إلى حالة بدائية. ثم ينظم الزرع نفسه لتشكيل نمط دوري جديد مستقل عن الإشارات السابقة13. يمكن استخدام نموذج إعادة تكوين الجلد هذا لدراسة العمليات الأولية للزخرفة الدورية للريش. استخدمنا هذا الأسلوب لاستكشاف كيف يمكن أن يؤثر تعديل نسبة خلايا اللحمة المتوسطة إلى قطعة واحدة من الظهارة على حجم أو عدد براعم الريش. وجد أن عدد البراعم يزداد ولكن ليس حجم البراعم مع زيادة نسبة خلايا اللحمة المتوسطة. ميزة أخرى لهذا النهج هي أن النقل الفيروسي للخلايا الوسيطة يظهر كفاءة أعلى مما هو عليه في حالتي الثقافة الأخريين ويمكن أن ينتج أنماطا ظاهرية أكثر وضوحا.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر إعادة تركيب الأنسجة مقايسة لاستكشاف المساهمات الفريدة للظهارة واللحمة المتوسطة. في الدجاج ، يبدأ الريش في التطور في اليوم الجنيني 7 (E7) بينما تبدأ القشور في E9. عندما يتم إعادة دمج اللحمة المتوسطة على نطاق E9 مع ظهارة الريش E7 ، تشكل الأنسجة المعاد تجميعها قشور ، وعندما يتم إعادة دمج اللح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من خلال منحة NIAMS من المعاهد الوطنية للصحة R37 AR 060306 و R01 AR 047364 و RO1 AR078050. كما يتم دعم العمل من خلال عقد بحث تعاوني بين جامعة جنوب كاليفورنيا وجامعة الصين الطبية في تايوان. نشكر فئة USC BISC 480 Developmental Biology 2023 على الاختبار الناجح لبروتوكول زراعة جلد الطيور هذا خلال العديد من الوحدات المعملية.
Materials
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, (1972).
- Sengel, P. . In Morphogenesis of Skin, l-277. , (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, . Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -. X., Noveen, A., Chen, C. -. W. J., Chuong, C. -. M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -. M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
