Explantaten van de vogelhuid gebruiken om weefselpatronen en organogenese te bestuderen
Summary
Hier beschrijven we protocollen voor drie soorten vogelembryonale huidexplantatieculturen die kunnen worden gebruikt om weefselinteracties te onderzoeken, 4D-beeldvorming timelapse-film (3D plus tijd), globale of lokale verstoring van de moleculaire functie en karakterisering van systeembiologie.
Abstract
De zich ontwikkelende vogelhuid tijdens de embryogenese is een uniek model dat waardevolle inzichten kan verschaffen in weefselpatronen. Hier worden drie variaties op huidexplantatieculturen beschreven om verschillende aspecten van huidontwikkeling te onderzoeken. Ten eerste bieden ex vivo orgaanculturen en manipulaties onderzoekers de mogelijkheid om de ontwikkeling van verenknoppen direct te observeren en te bestuderen. De explantatiecultuur van de huid kan 7 dagen groeien, waardoor tijdens deze groeiperiode directe analyse van cellulair gedrag en 4D-beeldvorming met tussenpozen mogelijk is. Dit maakt ook fysieke en moleculaire manipulaties van kweekomstandigheden mogelijk om de weefselrespons te visualiseren. Groeifactorgecoate kralen kunnen bijvoorbeeld lokaal worden aangebracht om veranderingen in verenpatronen in een beperkt gebied te veroorzaken. Als alternatief kan virale transductie wereldwijd worden toegediend in de kweekmedia om de genexpressie op of neer te reguleren. Ten tweede stelt het huidrecombinatieprotocol onderzoekers in staat om weefselinteracties tussen de epidermis en het mesenchym te onderzoeken die zijn afgeleid van verschillende huidregio’s, verschillende levensfasen of verschillende soorten. Dit biedt de mogelijkheid om het tijdvenster te testen waarin het epitheel in staat is om op signalen te reageren en het vermogen om verschillende huidaanhechtingen te vormen als reactie op signalen van verschillende mesenchymale bronnen. Ten derde reset huidreconstitutie met behulp van gedissocieerde huidcellen bedekt met intact epitheel de huidontwikkeling en maakt het de studie van de eerste processen van periodieke patroonvorming mogelijk. Deze aanpak verbetert ook ons vermogen om genexpressie tussen de gedissocieerde cellen te manipuleren voordat de gereconstitueerde huidexplantatie wordt gecreëerd. Dit artikel biedt de drie cultuurprotocollen en voorbeeldexperimenten om hun nut aan te tonen.
Introduction
De ontwikkeling van de huid van vogelembryo’s is een uitstekend model voor het bestuderen van de mechanismen van morfogenese vanwege de duidelijke patronen en de toegankelijkheid tot microchirurgie en manipulatie 1,2. Het evalueren van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen in intacte weefsels kan echter moeilijk zijn, omdat de aanwezigheid van externe weefsels microscopische waarnemingen kan bemoeilijken. Bovendien is het vermogen om genexpressie te manipuleren om hun rol in huidmorfogenese te testen niet altijd een eenvoudige taak. We ontdekken dat we genfuncties kunnen testen met behulp van retrovirale transductie met een hoger slagingspercentage met behulp van huidexplantatiemodellen. Hier bespreken we de voordelen van drie huidexplantatiemodellen die zijn ontwikkeld.
Aviaire embryonale huidcultuur is een krachtig systeem om celgedrag, genregulatie en functie tijdens de ontwikkeling van huidverenknoppen te beoordelen 3,4,5,6. Het maakt de evaluatie mogelijk van de moleculaire mechanismen van de ontwikkeling van verenknoppen door de wereldwijde toevoeging van groeifactoren die in de kweekmedia zijn geplaatst of hun lokale afgifte van met groeifactor gecoate kralen. Ontwikkelingsregulerende genen kunnen ook worden gemanipuleerd met behulp van virale gentransductie van intacte of dominante negatieve vormen voor functionele studies die hun rol in specifieke morfogenetische gebeurtenissen evalueren 7,8.
Aviaire epitheliale-mesenchymale recombinatiecultuur stelt onderzoekers in staat om de bijdragen van elke huidcomponent tijdens de vroege stadia van huidmorfogenese te bepalen. Rawles’ gebruik van deze benadering toonde aan dat interacties tussen het mesenchym en het epitheel essentieel zijn voor de vorming van huidaanhechtingen9. Het mesenchym kan condensaties vormen en het epitheel is nodig om mesenchymale condensatieformaties te induceren en in stand te houden2. Later werd deze benadering gebruikt om te beoordelen waarom schaalloze kippen geen veren vormen. Het defect bleek zich in mesenchym10 te bevinden. Dhouailly voerde weefselepitheel-mesenchymale recombinatiestudies uit bij embryo’s van verschillende soorten. Deze studies leverden ontwikkelings- en evolutionaire inzichten op in epitheel-mesenchymale communicatie die huidmorfogenese bevordert3.
Deze studie werd gebruikt om beter inzicht te krijgen in factoren die de groei van veren beheersen. De methode verbetert ook de visualisatie van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij huidpatronen die plaatsvinden tijdens het initiëren, ontwikkelen en verlengen van veren langs de voorste-achterste as. Wanneer het epitheel wordt gescheiden van het mesenchym en de twee componenten vervolgens opnieuw worden gecombineerd, herstellen nieuwe interacties het huidpatroon. Deze benadering stelt ons in staat om mesenchymale inducerende signalen en epitheliale competentiemoleculen te evalueren die de epidermis in staat stellen te reageren op de mesenchymale signalen11. De daaropvolgende stroomafwaartse moleculaire expressie die nodig is voor de ontwikkeling van veerknoppen en patroonvorming kan ook worden onderzocht. Deze studies hebben aangetoond dat de locatie van knoppen wordt gecontroleerd door het mesenchym. Rotatie van het epitheel 90o vóór recombinatie met het mesenchym toont aan dat de richting van de verlenging van de veerknop wordt gecontroleerd door het epitheel. Deze methode was essentieel voor ons om het moleculaire mechanisme te bestuderen dat de oriëntatie van de veerknop reguleert12.
Aviaire huidreconstitutiecultuur, waarbij het huidmesenchym wordt gedissocieerd tot enkele cellen voordat het met hoge celdichtheid wordt bekleed en bedekt met intact epitheel, reset huidcellen naar een primordiale toestand. De explantatie organiseert zichzelf vervolgens om een nieuw periodiek patroon te vormen, onafhankelijk van de vorige signalen13. Dit huidreconstitutiemodel kan worden gebruikt om de initiële processen van periodieke patronen van veren te bestuderen. We gebruikten deze benadering om te onderzoeken hoe het moduleren van de verhouding tussen mesenchymale cellen en een enkel stuk epitheel de grootte of het aantal veerknoppen kan beïnvloeden. Het aantal knoppen bleek toe te nemen, maar niet de grootte van de knoppen omdat de verhouding van mesenchymale cellen toenam. Een ander voordeel van deze aanpak is dat virale transductie van mesenchymale cellen een hogere efficiëntie vertoont dan in de andere twee kweekomstandigheden en meer voor de hand liggende fenotypes kan produceren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Weefselrecombinatie biedt een test om de unieke bijdragen van het epitheel en mesenchym te onderzoeken. Bij kippen beginnen de veren zich te ontwikkelen op embryonale dag 7 (E7), terwijl de schubben beginnen bij E9. Wanneer E9-schaalmesenchym wordt gerecombineerd met E7-verenepitheel, vormt het gerecombineerde weefsel schubben en wanneer E7-veermesenchym wordt gerecombineerd met E9-schaalepitheelveren worden gevormd11. Deze studies hebben aangetoond dat het mesenchym de patroonvorming, afstand tus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH NIAMS-subsidie R37 AR 060306, R01 AR 047364 en RO1 AR078050. Het werk wordt ook ondersteund door een samenwerkingsverband voor onderzoek tussen USC en China Medical University in Taiwan. We bedanken de USC BISC 480 Developmental Biology 2023-klas voor het succesvol testen van dit vogelhuidkweekprotocol tijdens verschillende laboratoriummodules.
Materials
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, (1972).
- Sengel, P. . In Morphogenesis of Skin, l-277. , (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, . Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -. X., Noveen, A., Chen, C. -. W. J., Chuong, C. -. M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -. M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
