Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması
Summary
Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.
Abstract
Embriyogenez sırasında gelişen kuş derisi, doku modellemesi hakkında değerli bilgiler sağlayabilen benzersiz bir modeldir. Burada, cilt gelişiminin farklı yönlerini incelemek için deri eksplant kültürlerinde üç varyasyon açıklanmaktadır. İlk olarak, ex vivo organ kültürleri ve manipülasyonları, araştırmacılara tüy tomurcuklarının gelişimini doğrudan gözlemleme ve inceleme fırsatları sunar. Deri eksplant kültürü 7 gün boyunca büyüyebilir ve bu büyüme periyodu boyunca aralıklarla hücresel davranışın doğrudan analizine ve 4D görüntülemeye olanak tanır. Bu aynı zamanda doku tepkisini görselleştirmek için kültür koşullarının fiziksel ve moleküler manipülasyonlarına da izin verir. Örneğin, büyüme faktörü kaplı boncuklar, sınırlı bir alanda tüy deseninde değişikliklere neden olmak için yerel olarak uygulanabilir. Alternatif olarak, viral transdüksiyon, gen ekspresyonunu yukarı veya aşağı regüle etmek için kültür ortamında küresel olarak verilebilir. İkincisi, cilt rekombinasyon protokolü, araştırmacıların farklı cilt bölgelerinden, farklı yaşam evrelerinden veya farklı türlerden türetilen epidermis ve mezenşim arasındaki doku etkileşimlerini araştırmalarına olanak tanır. Bu, epitelin sinyallere yanıt vermeye yetkin olduğu zaman penceresini ve farklı mezenkimal kaynaklardan gelen sinyallere yanıt olarak farklı cilt uzantıları oluşturma yeteneğini test etme fırsatı verir. Üçüncüsü, sağlam epitel ile kaplanmış ayrışmış dermal hücreler kullanılarak cildin sulandırılması, cilt gelişimini sıfırlar ve periyodik modellemenin ilk süreçlerinin incelenmesini sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda, yeniden yapılandırılmış deri eksplantını oluşturmadan önce ayrışmış hücreler arasındaki gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneğimizi de geliştirir. Bu makale, faydalarını göstermek için üç kültür protokolünü ve örnek deneyleri sunmaktadır.
Introduction
Kuş embriyosu derisi gelişimi, farklı desenler ve mikrocerrahi ve manipülasyona erişilebilirlik nedeniyle morfogenez mekanizmalarını incelemek için mükemmel bir modeldir 1,2. Bununla birlikte, sağlam dokulardaki hücresel ve moleküler olayları değerlendirmek zor olabilir, çünkü yabancı dokuların varlığı mikroskobik gözlemleri zorlaştırabilir. Ayrıca, cilt morfogenezindeki rollerini test etmek için gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneği her zaman basit bir iş değildir. Deri eksplant modellerini kullanarak daha yüksek bir başarı oranıyla retroviral transdüksiyon kullanarak gen fonksiyonlarını test edebileceğimizi bulduk. Burada, geliştirilmiş olan üç cilt eksplant modelinin avantajlarını tartışıyoruz.
Kuş embriyonik deri kültürü, deri tüy tomurcuğu gelişimi sırasında hücre davranışını, gen regülasyonunu ve işlevini değerlendirmek için güçlü bir sistemdir 3,4,5,6. Tüy tomurcuğu gelişiminin moleküler mekanizmalarının, kültür ortamına yerleştirilen büyüme faktörlerinin küresel olarak eklenmesi veya bunların büyüme faktörü kaplı boncuklardan yerel olarak salınması yoluyla değerlendirilmesine izin verir. Gelişimsel düzenleyici genler, spesifik morfogenetik olaylardaki rollerini değerlendiren fonksiyonel çalışmalar için bozulmamış veya baskın negatif formların viral gen iletimi kullanılarak da manipüle edilebilir 7,8.
Kuş epitelyal-mezenkimal rekombinasyon kültürü, araştırmacıların cilt morfogenezinin erken aşamalarında her bir cilt bileşeninin katkılarını belirlemelerini sağlar. Rawles’ın bu yaklaşımı kullanması, mezenşim ve epitel arasındaki etkileşimlerin cilt eklerinin oluşturulması için gerekli olduğunu ortaya koymuştur9. Mezenkim yoğuşmalar oluşturabilir ve mezenkimal yoğuşma oluşumlarını indüklemek ve sürdürmek için epitel gereklidir2. Daha sonra, bu yaklaşım Pulsuz tavukların neden tüy oluşturamadığını değerlendirmek için kullanıldı. Defektin mezenkim10’da olduğu keşfedildi. Dhouailly, farklı türlerden embriyolarda doku epitelyal-mezenkimal rekombinasyon çalışmaları yaptı. Bu çalışmalar, cilt morfogenezini destekleyen epitelyal-mezenkimal iletişime gelişimsel ve evrimsel içgörüler sağladı3.
Bu çalışma, tüy büyümesini kontrol eden faktörleri daha iyi anlamak için kullanılmıştır. Yöntem ayrıca, ön-arka eksen boyunca tüy başlangıcı, gelişimi ve uzaması sırasında meydana gelen deri desenlemesinde yer alan hücresel ve moleküler olayların görselleştirilmesini de geliştirir. Epitel mezenşimden ayrıldığında ve iki bileşen daha sonra yeniden birleştirildiğinde, yeni etkileşimler cilt desenini yeniden oluşturur. Bu yaklaşım, epidermisin mezenkimal sinyallere yanıt vermesini sağlayan mezenkimal indükleyici sinyalleri ve epitelyal yeterlilik moleküllerinideğerlendirmemize izin verir 11. Tüy tomurcuğu gelişimi ve desen oluşumu için gerekli olan sonraki aşağı akış moleküler ifadesi de incelenebilir. Bu çalışmalar, tomurcukların konumunun mezenşim tarafından kontrol edildiğini ortaya koymuştur. Mezenşim ile rekombinasyondan önce epitelin 90o dönmesi, tüy tomurcuğu uzama yönünün epitel tarafından kontrol edildiğini gösterir. Bu yöntem, tüy tomurcuğu oryantasyonunu düzenleyen moleküler mekanizmayı incelememiz için gerekliydi12.
Deri mezenşiminin yüksek hücre yoğunluğunda kaplamadan önce tek hücrelere ayrıldığı ve sağlam epitel ile kaplandığı kuş derisi sulandırma kültürü, dermal hücreleri ilkel bir duruma sıfırlar. Eksplant daha sonra önceki ipuçlarından bağımsız olarak yeni bir periyodik model oluşturmak için kendi kendini organize eder13. Bu cilt sulandırma modeli, tüy periyodik desenlemenin ilk süreçlerini incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşımı, mezenkimal hücrelerin tek bir epitel parçasına oranının modüle edilmesinin tüy tomurcuklarının boyutunu veya sayısını nasıl etkileyebileceğini keşfetmek için kullandık. Mezenkimal hücrelerin oranı arttıkça tomurcuk sayısının arttığı, ancak tomurcukların boyutunun artmadığı bulundu. Bu yaklaşımın bir başka avantajı, mezenkimal hücre viral transdüksiyonunun diğer iki kültür koşuluna göre daha yüksek verimlilik göstermesi ve daha belirgin fenotipler üretebilmesidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doku rekombinasyonu, epitel ve mezenşimin benzersiz katkılarını keşfetmek için bir test sağlar. Tavuklarda tüyler embriyonik gün 7’de (E7) gelişmeye başlarken, pullar E9’da başlar. E9 skalası mezenşimi, E7 skalası epiteli ile yeniden birleştirildiğinde, yeniden birleşen doku pulcukları oluşturur ve E7 tüy mezenşimi, E9 skalası epitel ile yeniden birleştirildiğinde, tüyler oluşur11. Bu çalışmalar, mezenkimin patern oluşumunu, aralığını ve organ kimliğini kontrol …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH NIAMS hibesi R37 AR 060306, R01 AR 047364 ve RO1 AR078050 tarafından desteklenmektedir. Çalışma aynı zamanda USC ile Tayvan’daki Çin Tıp Üniversitesi arasında ortak bir araştırma sözleşmesi ile de destekleniyor. USC BISC 480 Gelişimsel Biyoloji 2023 sınıfına, bu kuş deri kültürü protokolünü çeşitli laboratuvar modülleri sırasında başarıyla test ettikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, (1972).
- Sengel, P. . In Morphogenesis of Skin, l-277. , (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, . Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -. X., Noveen, A., Chen, C. -. W. J., Chuong, C. -. M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -. M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -. X., Chuong, C. -. M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
