Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli
Summary
Qui, discutiamo di un flusso di lavoro per preparare, sezionare, montare e visualizzare cervelli di espianti vivi da larve di terzo stadio di Drosophila melanogaster per osservare le dinamiche cellulari e subcellulari in condizioni fisiologiche.
Abstract
Le cellule staminali neurali della Drosophila (neuroblasti, NB in seguito) subiscono divisioni asimmetriche, rigenerando il neuroblasto auto-rinnovante, formando anche una cellula madre gangliare differenziante (GMC), che subirà una divisione aggiuntiva per dare origine a due neuroni o glia. Studi in NB hanno scoperto i meccanismi molecolari alla base della polarità cellulare, dell’orientamento del fuso, dell’auto-rinnovamento delle cellule staminali neurali e della differenziazione. Queste divisioni cellulari asimmetriche sono facilmente osservabili tramite imaging di cellule vive, rendendo le NB larvali ideali per studiare le dinamiche spaziotemporali della divisione cellulare asimmetrica nei tessuti viventi. Se adeguatamente sezionati e ripresi in un mezzo integrato con sostanze nutritive, gli NB nei cervelli espiantati si dividono robustamente per 12-20 ore. I metodi descritti in precedenza sono tecnicamente difficili e possono essere impegnativi per chi è nuovo nel campo. Qui, viene descritto un protocollo per la preparazione, la dissezione, il montaggio e l’imaging di espianti cerebrali larvali vivi di terza stella utilizzando integratori per il corpo grasso. Vengono inoltre discussi i potenziali problemi e vengono forniti esempi su come questa tecnica può essere utilizzata.
Introduction
La divisione cellulare asimmetrica (ACD) è il processo mediante il quale componenti subcellulari come RNA, proteine e organelli sono partizionati in modo diseguale tra le cellule figlie 1,2. Questo processo è comunemente visto nelle cellule staminali, che subiscono ACD per dare origine a cellule figlie con diversi destini di sviluppo. Drosofila Le NB si dividono asimmetricamente per produrre una NB, che mantiene la sua staminalità, e una cellula madre gangliare (GMC). Il GMC subisce ulteriori divisioni per produrre neuroni differenzianti o glia3. Le NB che si dividono asimmetricamente sono abbondanti nei cervelli in via di sviluppo delle larve di terzo stadio, che sono facilmente osservabili al microscopio. Al terzo stadio larvale instar, ci sono circa 100 NB presenti in ogni lobo cerebrale centrale 3,4,5,6.
La divisione cellulare asimmetrica è un processo altamente dinamico. I protocolli di imaging delle cellule vive sono stati utilizzati per misurare e quantificare la dinamica della polarità cellulare 7,8,9,10, l’orientamento del fuso 11,12,13, la dinamica della corteccia dell’attomiosina14,15,16,17,18, la biologia dei microtubuli e dei centrosomi 19,20,21,22,23,24,25,26,27, e membrana 10,28 e dinamica della cromatina 29. Le descrizioni qualitative e quantitative dell’ACD si basano su metodi e protocolli robusti per la divisione delle immagini NB in cervelli viventi intatti. Il seguente protocollo delinea i metodi per preparare, sezionare e visualizzare cervelli larvali di terzo stadio per l’imaging di cellule vive in vivo utilizzando due diversi approcci di montaggio. Questi metodi sono più adatti per i ricercatori interessati alle dinamiche spaziotemporali delle divisioni delle cellule staminali, nonché alle divisioni in altre cellule cerebrali, in quanto consentono osservazioni a breve e lungo termine di eventi cellulari. Inoltre, queste tecniche sono facilmente accessibili ai nuovi arrivati sul campo. Dimostriamo l’efficacia e l’adattabilità di questo approccio con cervelli larvali che esprimono microtubuli marcati in modo fluorescente e proteine di fusione corticale. Discutiamo inoltre i metodi di analisi e le considerazioni per l’applicazione in altri studi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo delinea un approccio per l’imaging di cervelli vivi espiantati da larve di Drosophila melanogaster . Il protocollo qui descritto consente di osservare cervelli espiantati per 12-20 ore nelle giuste condizioni sperimentali. Particolare attenzione deve essere data alla preparazione dei campioni e alla progettazione degli esperimenti desiderati. Come accennato in precedenza, uno dei fattori più critici che determina la qualità del tessuto sezionato è la salute delle larve. Per ottenere la massi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è supportata da R35GM148160 (C. C.) e da un National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
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