הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי
Summary
כאן, אנו דנים בתהליך עבודה להכנה, ניתוח, הרכבה ותמונה של מוחות צמחים חיים מזחלי Drosophila melanogaster Third instar כדי לצפות בדינמיקה התאית והתת-תאית בתנאים פיזיולוגיים.
Abstract
תאי גזע עצביים דרוזופילה (נוירובלסטים, NBs להלן) עוברים חלוקות אסימטריות, מחדשות את הנוירובלסט המתחדש מעצמו, תוך יצירת תא אם גנגליון מתמיין (GMC), שיעבור חלוקה אחת נוספת כדי ליצור שני נוירונים או גליה. מחקרים ב- NBs חשפו את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס קוטביות התא, כיוון הציר, התחדשות עצמית של תאי גזע עצביים והתמיינות. חלוקות תאים אסימטריות אלה ניתנות לצפייה בקלות באמצעות הדמיה של תאים חיים, מה שהופך את NBs הזחלים למתאימים באופן אידיאלי לחקר הדינמיקה המרחבית-זמנית של חלוקת תאים אסימטרית ברקמה חיה. כאשר מנתחים אותם כראוי ומדמיינים אותם במדיום עם תוספי תזונה, NBs במוחות explant מתחלקים בצורה חזקה במשך 12-20 שעות. שיטות שתוארו קודם לכן הן קשות מבחינה טכנית ועשויות להיות מאתגרות לאלה החדשים בתחום. כאן, מתואר פרוטוקול להכנה, נתיחה, הרכבה והדמיה של צמחי מוח חיים של זחל שלישי באמצעות תוספי גוף שמנים. בעיות פוטנציאליות נדונות גם, ודוגמאות מסופקות כיצד טכניקה זו ניתן להשתמש.
Introduction
חלוקת תאים אסימטרית (ACD) היא התהליך שבו רכיבים תת-תאיים כגון רנ”א, חלבונים ואברונים מחולקים באופן לא שווה בין תאי בת 1,2. תהליך זה נפוץ בתאי גזע, אשר עוברים ACD כדי ליצור תאי בת עם גורלות התפתחותיים שונים. דרוזופילה NBs מתחלקים באופן א-סימטרי כדי לייצר NB אחד, ששומר על הגבעול שלו, ותא אם גנגליון אחד (GMC). GMC עובר חלוקות נוספות כדי לייצר נוירונים מתמיינים או גליה3. NBs המתחלקים באופן א-סימטרי נמצאים בשפע במוחות המתפתחים של זחלי כוכב שלישי, אשר נצפים בקלות באמצעות מיקרוסקופיה. בשלב הזחל השלישי של הכוכב, ישנם בערך 100 NBs נוכחים בכל אונת מוח מרכזית 3,4,5,6.
חלוקת תאים אסימטרית היא תהליך דינמי ביותר. פרוטוקולי הדמיה של תאים חיים שימשו למדידה וכימות של הדינמיקה של קוטביות התא 7,8,9,10, כיוון ציר 11,12,13, הדינמיקה של קליפת המוח אקטומיוזין14,15,16,17,18, מיקרוטובול וביולוגיה צנטרוזומית 19,20,21,22,23,24,25,26,27, וממברנה 10,28 ודינמיקה של כרומטין 29. תיאורים איכותיים וכמותיים של ACD מסתמכים על שיטות ופרוטוקולים חזקים כדי לדמיין חלוקת NBs במוחות חיים שלמים. הפרוטוקול הבא מתאר שיטות להכנה, ניתוח ותמונה של מוחות זחלי כוכב שלישי להדמיית תאים חיים in vivo באמצעות שתי גישות הרכבה שונות. שיטות אלה מתאימות ביותר לחוקרים המתעניינים בדינמיקה מרחבית-זמנית של חלוקות תאי גזע, כמו גם חלוקות בתאי מוח אחרים, שכן הן מאפשרות תצפיות קצרות וארוכות טווח של אירועים תאיים. בנוסף, טכניקות אלה נגישות בקלות למצטרפים חדשים לתחום. אנו מדגימים את היעילות ויכולת ההסתגלות של גישה זו עם מוחות זחלים המבטאים מיקרוטובולים מתויגים פלואורסצנטית וחלבוני היתוך קליפת המוח. כמו כן נדון בשיטות ניתוח ובשיקולים ליישום במחקרים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתווה גישה אחת לדימות של מוחות צמחים חיים מזחלי Drosophila melanogaster . הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לצפות במוחות של צמחים במשך 12-20 שעות בתנאי הניסוי המתאימים. יש לתת תשומת לב מיוחדת להכנת הדגימות ולתכנון הניסויים הרצויים. כאמור, אחד הגורמים הקריטיים ביותר הקובעים את איכות הרקמה המנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי R35GM148160 (C. C.) ומענק הכשרה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) T32 GM007270 (R. C. S)
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -. Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
