Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi
Summary
Burada, fizyolojik koşullar altında hücresel ve hücre altı dinamikleri gözlemlemek için Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarından canlı eksplant beyinlerini hazırlamak, parçalamak, monte etmek ve görüntülemek için bir iş akışını tartışıyoruz.
Abstract
Drosophila nöral kök hücreleri (nöroblastlar, bundan sonra NB’ler) asimetrik bölünmelere uğrar, kendini yenileyen nöroblastı yenilerken, aynı zamanda iki nöron veya glia’ya yol açmak için ek bir bölünmeye uğrayacak olan farklılaştırıcı bir gangliyon ana hücresi (GMC) oluşturur. NB’lerde yapılan çalışmalar, hücre polaritesi, iğ oryantasyonu, nöral kök hücre kendini yenileme ve farklılaşmanın altında yatan moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. Bu asimetrik hücre bölünmeleri, canlı hücre görüntüleme yoluyla kolayca gözlemlenebilir, bu da larva NB’leri canlı dokudaki asimetrik hücre bölünmesinin mekansal zamansal dinamiklerini araştırmak için ideal hale getirir. Besin takviyeli ortamda düzgün bir şekilde diseke edildiğinde ve görüntülendiğinde, eksplant beyinlerindeki NB’ler 12-20 saat boyunca sağlam bir şekilde bölünür. Daha önce açıklanan yöntemler teknik olarak zordur ve bu alanda yeni olanlar için zorlayıcı olabilir. Burada, yağ vücut takviyeleri kullanılarak canlı üçüncü instar larva beyin eksplantlarının hazırlanması, diseksiyonu, montajı ve görüntülenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Olası problemler de tartışılmakta ve bu tekniğin nasıl kullanılabileceğine dair örnekler verilmektedir.
Introduction
Asimetrik hücre bölünmesi (ACD), RNA, proteinler ve organeller gibi hücre altı bileşenlerinyavru hücreler 1,2 arasında eşit olmayan bir şekilde bölündüğü süreçtir. Bu süreç, farklı gelişimsel kaderlere sahip yavru hücrelere yol açmak için ACD’ye maruz kalan kök hücrelerde yaygın olarak görülür. Drosophila NB’ler, kökünü koruyan bir NB ve bir ganglion ana hücresi (GMC) üretmek için asimetrik olarak bölünür. GMC, farklılaştırıcı nöronlar veya glia3 üretmek için daha fazla bölünmeye uğrar. Asimetrik olarak bölünen NB’ler, mikroskopi ile kolayca gözlemlenen üçüncü instar larvalarının gelişmekte olan beyinlerinde bol miktarda bulunur. Üçüncü instar larva aşamasında, her bir merkezi beyin lobundayaklaşık 100 NB bulunur 3,4,5,6.
Asimetrik hücre bölünmesi oldukça dinamik bir süreçtir. Canlı hücre görüntüleme protokolleri, hücre polaritesi 7,8,9,10, iğ oryantasyonu11,12,13, aktomiyosin korteksdinamiği 14,15,16,17,18, mikrotübül ve sentrozom biyolojisi 19,20 dinamiklerini ölçmek ve ölçmek için kullanılmıştır,21,22,23,24,25,26,27 ve membran 10,28 ve kromatin dinamiği 29. ACD’nin nitel ve nicel açıklamaları, sağlam canlı beyinlerde NB’leri bölmek için sağlam yöntemlere ve protokollere dayanır. Aşağıdaki protokol, iki farklı montaj yaklaşımı kullanarak in vivo canlı hücre görüntüleme için üçüncü instar larva beyinlerini hazırlama, disseke etme ve görüntüleme yöntemlerini özetlemektedir. Bu yöntemler, kök hücre bölünmelerinin mekansal zamansal dinamiklerinin yanı sıra diğer beyin hücrelerindeki bölünmelerle ilgilenen araştırmacılar için en uygun olanıdır, çünkü hücresel olayların kısa ve uzun vadeli gözlemlerine izin verirler. Ek olarak, bu tekniklere alana yeni gelenler için kolayca erişilebilir. Bu yaklaşımın etkinliğini ve uyarlanabilirliğini, floresan olarak etiketlenmiş mikrotübül ve kortikal füzyon proteinlerini eksprese eden larva beyinleri ile gösteriyoruz. Ek olarak, analiz yöntemlerini ve diğer çalışmalarda uygulama için dikkat edilmesi gerekenleri tartışıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarından canlı eksplant beyinlerinin görüntülenmesi için bir yaklaşımı özetlemektedir. Burada açıklanan protokol, eksplant beyinlerinin doğru deneysel koşullar altında 12-20 saat boyunca gözlemlenmesini sağlar. Numunelerin hazırlanmasına ve istenen deneylerin tasarımına özel dikkat gösterilmelidir. Yukarıda belirtildiği gibi, disseke edilmiş dokunun kalitesini belirleyen en kritik faktörlerden biri larvaların sağlığıdır. Mümkün olan en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma R35GM148160 (C. C.) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Eğitim Hibesi T32 GM007270 (R. C. S) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -. Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
