Imagerie de cellules vivantes du cerveau larvaire du troisième stade de Drosophila melanogaster
Summary
Ici, nous discutons d’un flux de travail pour préparer, disséquer, monter et imager des cerveaux d’explants vivants de larves du troisième stade de Drosophila melanogaster afin d’observer la dynamique cellulaire et subcellulaire dans des conditions physiologiques.
Abstract
Les cellules souches neurales de la drosophile (neuroblastes, NBs ci-après) subissent des divisions asymétriques, régénérant le neuroblaste auto-renouvelant, tout en formant une cellule mère ganglionnaire différenciatrice (GMC), qui subira une division supplémentaire pour donner naissance à deux neurones ou glies. Des études sur les NB ont révélé les mécanismes moléculaires sous-jacents à la polarité cellulaire, à l’orientation du fuseau, à l’auto-renouvellement des cellules souches neurales et à la différenciation. Ces divisions cellulaires asymétriques sont facilement observables par imagerie de cellules vivantes, ce qui rend les NB larvaires idéales pour étudier la dynamique spatio-temporelle de la division cellulaire asymétrique dans les tissus vivants. Lorsqu’ils sont correctement disséqués et imagés dans un milieu enrichi en nutriments, les NB dans les cerveaux explantés se divisent vigoureusement pendant 12 à 20 heures. Les méthodes décrites précédemment sont techniquement difficiles et peuvent être difficiles pour ceux qui débutent dans le domaine. Ici, un protocole est décrit pour la préparation, la dissection, le montage et l’imagerie d’explants cérébraux larvaires vivants du troisième stade à l’aide de suppléments de corps gras. Les problèmes potentiels sont également discutés, et des exemples sont fournis sur la façon dont cette technique peut être utilisée.
Introduction
La division cellulaire asymétrique (DCA) est le processus par lequel les composants subcellulaires tels que l’ARN, les protéines et les organites sont répartis de manière inégale entre les cellules filles 1,2. Ce processus est couramment observé dans les cellules souches, qui subissent une DCA pour donner naissance à des cellules filles avec des destins de développement différents. Drosophile Les NB se divisent de manière asymétrique pour produire un NB, qui conserve sa souche, et une cellule mère ganglionnaire (GMC). Le GMC subit d’autres divisions pour produire des neurones différenciateurs ou glies3. Les NB à division asymétrique sont abondants dans le cerveau en développement des larves du troisième stade, qui sont facilement observées par microscopie. Au stade larvaire du troisième stade, il y a environ 100 NB présents dans chaque lobe central du cerveau 3,4,5,6.
La division cellulaire asymétrique est un processus très dynamique. Des protocoles d’imagerie de cellules vivantes ont été utilisés pour mesurer et quantifier la dynamique de la polarité cellulaire 7,8,9,10, l’orientation du fuseau 11,12,13, la dynamique du cortex actomyosine 14,15,16,17,18, la biologie des microtubules et des centrosomes 19,20,21,22,23,24,25,26,27, et membrane 10,28 et dynamique de la chromatine 29. Les descriptions qualitatives et quantitatives de la DCA reposent sur des méthodes et des protocoles robustes pour diviser les NB dans des cerveaux vivants intacts. Le protocole suivant décrit les méthodes de préparation, de dissection et d’imagerie des cerveaux larvaires du troisième stade pour l’imagerie de cellules vivantes in vivo à l’aide de deux approches de montage différentes. Ces méthodes conviennent mieux aux chercheurs qui s’intéressent à la dynamique spatio-temporelle des divisions de cellules souches, ainsi qu’aux divisions dans d’autres cellules du cerveau, car elles permettent d’observer des événements cellulaires à court et à long terme. De plus, ces techniques sont facilement accessibles aux nouveaux arrivants sur le terrain. Nous démontrons l’efficacité et l’adaptabilité de cette approche avec des cerveaux larvaires exprimant des microtubules marqués par fluorescence et des protéines de fusion corticale. Nous discutons également des méthodes d’analyse et des considérations pour l’application dans d’autres études.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une approche pour l’imagerie de cerveaux d’explants vivants provenant de larves de Drosophila melanogaster . Le protocole décrit ici permet d’observer les cerveaux d’explant pendant 12 à 20 h dans les bonnes conditions expérimentales. Une attention particulière doit être accordée à la préparation des échantillons et à la conception des expériences souhaitées. Comme mentionné ci-dessus, l’un des facteurs les plus critiques qui détermine la qualité du tissu disséqué …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche est soutenue par R35GM148160 (C. C.) et une subvention de formation T32 GM007270 (R. C. S) des National Institutes of Health (NIH)
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
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