Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster
Summary
Aqui, discutimos um fluxo de trabalho para preparar, dissecar, montar e obter imagens de cérebros de explantes vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster para observar a dinâmica celular e subcelular sob condições fisiológicas.
Abstract
As células-tronco neurais de Drosophila (neuroblastos, RNs doravante) sofrem divisões assimétricas, regenerando o neuroblasto auto-renovador, ao mesmo tempo em que formam uma célula-mãe do gânglio diferenciador (GMC), que sofrerá uma divisão adicional para dar origem a dois neurônios ou glia. Estudos em RNs descobriram os mecanismos moleculares subjacentes à polaridade celular, orientação fusiforme, auto-renovação e diferenciação de células-tronco neurais. Essas divisões celulares assimétricas são facilmente observáveis através de imagens de células vivas, tornando os RNs larvais ideais para investigar a dinâmica espaço-temporal da divisão celular assimétrica em tecidos vivos. Quando devidamente dissecados e imageados em meio suplementado com nutrientes, os RNs em cérebros explantes dividem-se robustamente por 12-20 h. Os métodos descritos anteriormente são tecnicamente difíceis e podem ser desafiadores para aqueles que estão começando na área. Aqui, um protocolo é descrito para a preparação, dissecção, montagem e imagem de explantes cerebrais de larvas de terceiro ínstar vivas usando suplementos de corpo gorduroso. Problemas potenciais também são discutidos, e exemplos são fornecidos de como essa técnica pode ser usada.
Introduction
A divisão celular assimétrica (DCA) é o processo pelo qual componentes subcelulares como RNA, proteínas e organelas são particionados desigualmente entre as células filhas 1,2. Esse processo é comumente visto em células-tronco, que sofrem DCA para dar origem a células-filhas com diferentes destinos de desenvolvimento. Drosófila Os RNs dividem-se assimetricamente para produzir um RN, que retém sua caule, e uma célula-mãe ganglionar (GMC). O GMC sofre novas divisões para produzir neurônios diferenciadores ou glia3. RNs em divisão assimétrica são abundantes no cérebro em desenvolvimento de larvas de terceiro ínstar, que são prontamente observados por microscopia. No estágio larval de terceiro ínstar, há cerca de 100 RNs presentes em cada lobo cerebral central3,4,5,6.
A divisão celular assimétrica é um processo altamente dinâmico. Protocolos de imagem de células vivas têm sido utilizados para medir e quantificar a dinâmica da polaridade celular 7,8,9,10, a orientação do fuso 11,12,13, a dinâmica do córtex da actomiosina14,15,16,17,18, a biologia dos microtúbulos e centrossomos 19,20,21,22,23,24,25,26,27, e membrana 10,28 e dinâmica da cromatina29. Descrições qualitativas e quantitativas de DCA baseiam-se em métodos e protocolos robustos para a divisão de imagens de RNs em cérebros vivos intactos. O protocolo a seguir descreve métodos para preparar, dissecar e obter imagens de cérebros de larvas de terceiro ínstar para imagens de células vivas in vivo usando duas abordagens de montagem diferentes. Esses métodos são mais adequados para pesquisadores interessados na dinâmica espaço-temporal de divisões de células-tronco, bem como divisões em outras células cerebrais, pois permitem observações de curto e longo prazo de eventos celulares. Além disso, essas técnicas são facilmente acessíveis aos recém-chegados ao campo. Nós demonstramos a eficácia e adaptabilidade desta abordagem com cérebros de larvas expressando microtúbulos fluorescentemente marcados e proteínas de fusão cortical. Além disso, discutimos métodos de análise e considerações para aplicação em outros estudos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve uma abordagem para a obtenção de imagens de cérebros vivos de explantes de larvas de Drosophila melanogaster . O protocolo aqui descrito permite que cérebros de explantes sejam observados por 12-20 h sob as condições experimentais adequadas. Atenção especial deve ser dada à preparação das amostras e ao planejamento dos experimentos desejados. Como mencionado acima, um dos fatores mais críticos que determinam a qualidade do tecido dissecado é a saúde das larvas. Para alcança…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa é apoiada por R35GM148160 (C. C.) e um National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
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