تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة
Summary
هنا ، نناقش سير العمل لإعداد وتشريح وتركيب وتصوير أدمغة الزرع الحية من يرقات ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر الثالثة لمراقبة الديناميكيات الخلوية ودون الخلوية في ظل الظروف الفسيولوجية.
Abstract
تخضع الخلايا الجذعية العصبية ذبابة الفاكهة (الخلايا العصبية ، NBs فيما بعد) لانقسامات غير متماثلة ، مما يؤدي إلى تجديد الخلايا العصبية ذاتية التجديد ، بينما تشكل أيضا خلية أم متمايزة (GMC) ، والتي ستخضع لتقسيم إضافي واحد ليؤدي إلى ظهور خليتين عصبيتين أو دبقية. كشفت الدراسات في NBs عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء قطبية الخلية ، واتجاه المغزل ، والتجديد الذاتي للخلايا الجذعية العصبية ، والتمايز. يمكن ملاحظة هذه الانقسامات الخلوية غير المتماثلة بسهولة عن طريق تصوير الخلايا الحية ، مما يجعل اليرقات NBs مناسبة بشكل مثالي للتحقيق في الديناميات الزمانية المكانية لانقسام الخلايا غير المتماثل في الأنسجة الحية. عند تشريحها وتصويرها بشكل صحيح في وسط مكمل بالمغذيات ، تنقسم NBs في أدمغة الزرع بقوة لمدة 12-20 ساعة. الأساليب الموصوفة سابقا صعبة تقنيا وقد تشكل تحديا لأولئك الجدد في هذا المجال. هنا ، يتم وصف بروتوكول لإعداد وتشريح وتركيب وتصوير نباتات دماغ اليرقات الحية الثالثة باستخدام مكملات الجسم الدهنية. كما تتم مناقشة المشاكل المحتملة ، ويتم تقديم أمثلة لكيفية استخدام هذه التقنية.
Introduction
انقسام الخلايا غير المتماثل (ACD) هو العملية التي يتم من خلالها تقسيم المكونات تحت الخلوية مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات والعضيات بشكل غير متساو بين الخلايا الوليدة 1,2. تظهر هذه العملية بشكل شائع في الخلايا الجذعية ، التي تخضع ل ACD لتؤدي إلى ظهور خلايا ابنة ذات مصائر تنموية مختلفة. ذبابة الفاكهة تنقسم NBs بشكل غير متماثل لإنتاج NB واحد ، والذي يحتفظ بجذعه ، وخلية أم واحدة (GMC). يخضع GMC لمزيد من الانقسامات لإنتاج الخلايا العصبية المتمايزة أو الدبقية3. NBs المقسمة بشكل غير متماثل وفيرة في الأدمغة النامية لليرقات الثالثة ، والتي يمكن ملاحظتها بسهولة عن طريق الفحص المجهري. في المرحلة الثالثة من اليرقات الداخلية ، يوجد ما يقرب من 100 NBs في كل فص دماغي مركزي3،4،5،6.
انقسام الخلايا غير المتماثل هو عملية ديناميكية للغاية. تم استخدام بروتوكولات تصوير الخلايا الحية لقياس وقياس ديناميكيات قطبية الخلية7،8،9،10 ، اتجاه المغزل 11،12،13 ، ديناميات قشرة الأكتوميوسين 14،15،16،17،18 ، الأنابيب الدقيقة وبيولوجيا الجسيم المركزي 19،20، 21،22،23،24،25،26،27 ، والغشاء10،28 وديناميات الكروماتين 29. تعتمد الأوصاف النوعية والكمية ل ACD على طرق وبروتوكولات قوية لتقسيم NBs في أدمغة حية سليمة. يحدد البروتوكول التالي طرق تحضير وتشريح وتصوير أدمغة اليرقات الثالثة لتصوير الخلايا الحية في الجسم الحي باستخدام طريقتين مختلفتين للتركيب. هذه الطرق هي الأنسب للباحثين المهتمين بالديناميكيات الزمانية المكانية لانقسامات الخلايا الجذعية ، وكذلك الانقسامات في خلايا الدماغ الأخرى ، لأنها تسمح بمراقبة الأحداث الخلوية على المدى القصير والطويل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الوصول بسهولة إلى هذه التقنيات للقادمين الجدد إلى هذا المجال. لقد أثبتنا فعالية هذا النهج وقدرته على التكيف مع أدمغة اليرقات التي تعبر عن الأنابيب الدقيقة الموسومة بالفلورسنت وبروتينات الاندماج القشري. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش طرق التحليل واعتبارات التطبيق في دراسات أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحدد هذا البروتوكول نهجا واحدا لتصوير أدمغة النباتات الحية من يرقات ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر . يسمح البروتوكول الموصوف هنا بمراقبة أدمغة الزرع لمدة 12-20 ساعة في ظل الظروف التجريبية المناسبة. يجب إيلاء اهتمام خاص لإعداد العينات وتصميم التجارب المطلوبة. كما ذكر أعلاه ، فإن أحد أهم ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا البحث من قبل R35GM148160 (C. C.) ومنحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (NIH) T32 GM007270 (R. C. S)
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -. Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
