Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster
Summary
Aquí, discutimos un flujo de trabajo para preparar, diseccionar, montar y obtener imágenes de cerebros de explante vivos de larvas del tercer estadio de Drosophila melanogaster para observar la dinámica celular y subcelular en condiciones fisiológicas.
Abstract
Las células madre neurales de Drosophila (neuroblastos, NB en adelante) experimentan divisiones asimétricas, regenerando el neuroblasto autorrenovador, al tiempo que forman una célula madre ganglionar diferenciadora (GMC), que sufrirá una división adicional para dar lugar a dos neuronas o glía. Los estudios en NB han descubierto los mecanismos moleculares subyacentes a la polaridad celular, la orientación del huso, la autorrenovación de las células madre neurales y la diferenciación. Estas divisiones celulares asimétricas son fácilmente observables a través de imágenes de células vivas, lo que hace que las larvas sean ideales para investigar la dinámica espaciotemporal de la división celular asimétrica en el tejido vivo. Cuando se diseccionan adecuadamente y se obtienen imágenes en un medio suplementado con nutrientes, los NB en los cerebros de explante se dividen robustamente durante 12-20 h. Los métodos descritos anteriormente son técnicamente difíciles y pueden ser desafiantes para aquellos nuevos en el campo. Aquí, se describe un protocolo para la preparación, disección, montaje e imágenes de explantes cerebrales larvales vivos del tercer estadio utilizando suplementos corporales gordos. También se discuten los problemas potenciales y se proporcionan ejemplos de cómo se puede utilizar esta técnica.
Introduction
La división celular asimétrica (ACD) es el proceso por el cual los componentes subcelulares como el ARN, las proteínas y los orgánulos se dividen de manera desigual entre las células hijas 1,2. Este proceso se ve comúnmente en las células madre, que se someten a ACD para dar lugar a células hijas con diferentes destinos de desarrollo. Drosophila Los NB se dividen asimétricamente para producir un NB, que conserva su tallo, y una célula madre ganglionar (GMC). El GMC sufre más divisiones para producir neuronas diferenciadoras o glía3. Los NB que se dividen asimétricamente son abundantes en los cerebros en desarrollo de las larvas del tercer estadio, que se observan fácilmente a través de la microscopía. En la tercera etapa larvaria del estadio, hay aproximadamente 100 NB presentes en cada lóbulo cerebral central 3,4,5,6.
La división celular asimétrica es un proceso altamente dinámico. Se han utilizado protocolos de imagen de células vivas para medir y cuantificar la dinámica de la polaridad celular 7,8,9,10, la orientación del huso 11,12,13, la dinámica de la corteza de actomiosina 14,15,16,17,18, la biología de microtúbulos y centrosomas 19,20,21,22,23,24,25,26,27, y membrana 10,28 y dinámica de la cromatina 29. Las descripciones cualitativas y cuantitativas de ACD se basan en métodos y protocolos robustos para dividir imágenes NB en cerebros vivos intactos. El siguiente protocolo describe métodos para preparar, diseccionar y obtener imágenes de cerebros larvales del tercer estadio para obtener imágenes de células vivas in vivo utilizando dos enfoques de montaje diferentes. Estos métodos son más adecuados para investigadores interesados en la dinámica espaciotemporal de las divisiones de células madre, así como las divisiones en otras células cerebrales, ya que permiten observaciones a corto y largo plazo de eventos celulares. Además, estas técnicas son fácilmente accesibles para los recién llegados al campo. Demostramos la efectividad y adaptabilidad de este enfoque con cerebros larvales que expresan microtúbulos marcados fluorescentemente y proteínas de fusión cortical. Además, discutimos los métodos de análisis y las consideraciones para su aplicación en otros estudios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un enfoque para la obtención de imágenes de cerebros de explante vivos de larvas de Drosophila melanogaster . El protocolo descrito aquí permite observar cerebros de explante durante 12-20 h en las condiciones experimentales adecuadas. Se debe prestar especial atención a la preparación de muestras y al diseño de los experimentos deseados. Como se mencionó anteriormente, uno de los factores más críticos que determina la calidad del tejido disecado es la salud de las larvas. Para l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación cuenta con el apoyo de R35GM148160 (C. C.) y una subvención de capacitación T32 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) GM007270 (R. C. S)
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
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