Análise de fluxo dual-reporter baseada em esferas fluorescentes magnéticas do bloqueio de anticorpos induzido pela vacina do peptídeo PDL1-Vaxx da interação PD-1/PD-L1

1. Preparação experimental NOTA: Os detalhes de todos os reagentes/equipamentos mencionados nesta etapa estão listados na Tabela de Materiais. Obter PD-1 humano recombinante (rhPD-1; poli-histidina marcada). Reconstituir rhPD1 liofilizado com solução salina tamponada com fosfato filtrado estéril (PBS), pH 7,4, antes do uso. Obter PD-L1 humano recombinante biotinilado (rhPD-L1). Reconstituir rhPD-L1 liofilizado com água deionizada estéril antes do uso. Obter reagente de detecção R-ficoeritrina conjugado com estreptavidina (SAPE). Armazene todas as soluções SAPE protegidas da luz em temperaturas de geladeira (ou seja, 2-8 °C). Obter microesferas magnéticas tingidas fluorescentemente (6,5 μm de diâmetro, poliestireno com magnetita incorporada) e o Bead Coupling Kit15 (se usado, consulte a Tabela de Materiais). O acoplamento covalente às microesferas requer sulfo-NHS (sulfo-N-hidrosuccinimida) e EDC (cloridrato de N-[3-dimetilaminopropil]-N′-etilcarbodiimida).NOTA: Os conjuntos de contas magnéticas estão disponíveis com qualquer uma das 500 etiquetas fluorescentes exclusivas, o que permite a identificação e diferenciação de diferentes conjuntos de contas16. As contas são oferecidas em concentrações de estoque de 2,5 × 106 contas/mL e 12,5 × 106 contas/mL. Armazene as contas protegidas da luz em temperaturas de geladeira (ou seja, 2-8 °C). Não congele as suspensões de contas. Obter anticorpos de controle positivo e negativo e anticorpos de detecção secundária marcados com Brilliant Violet 421 (BV421). Armazene todas as moléculas fluorescentes-conjugadas protegidas da luz. Realizar todas as reações de acoplamento em tubos de baixa ligação de proteínas e todas as reações de ensaio em placas de microtitulação de 96 poços de baixa ligação proteica, fundo redondo. Sele as placas com folha adesiva descartável ou tampas plásticas de microplacas de 96 poços para as etapas de incubação do ensaio. Use um separador magnético de placas para imobilizar as esferas durante as etapas de lavagem do ensaio.NOTA: O sistema de análise de fluxo dual-reporter possui três lasers: (1) um que identifica e quantifica a fluorescência específica do conjunto de esferas (Canal de Classificação); (2) um que detecta e quantifica a fluorescência da ficoeritrina (PE) alvo-específica (Canal Repórter 1; excitação de 532 nm, emissão “laranja” de 565-585 nm); e (3) um que detecta e quantifica a fluorescência BV421 alvo-específica de um segundo analito alvo (Reporter Channel 2; excitação de 405 nm, emissão “azul” de 421-441 nm). 2. Acoplamento rhPD-1 a esferas magnéticas NOTA: A proteína a ser acoplada deve estar isenta de albumina de soro bovino (BSA), azida sódica, glicina, glicerol, tris(hidroximetil)aminometano (Tris) ou aditivos contendo amina e deve ser suspensa em PBS em pH 7,4. Está disponível um kit de acoplamento comercial que inclui todos os reagentes e buffers necessários descritos aqui (consulte a Tabela de Materiais). Retire todos os reagentes de acoplamento do refrigerador e deixe-os se equilibrar à temperatura ambiente (TR, 18-22 °C) por 20-30 min. Ressuspenda as microesferas de estoque por vórtice breve, sonicação ou rotação (15 min a 15-30 rpm), de acordo com a folha de informações do produto. Transfira 1 × 106 esferas magnéticas para um tubo de microcentrífuga de ligação de 1,5 ml com baixo teor de proteínas (ver Tabela de Materiais). Lavar contas com 100 μL de tampão de ativação15: 0,1 M NaH2PO4 (monobásico), pH 6,2.NOTA: O acoplamento também pode ser realizado usando um Kit de Acoplamento pré-configurado, que inclui ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES) 0,1 M, pH 6,0, como um buffer alternativo de ativação e acoplamento (consulte a Tabela de Materiais).Coloque o tubo contendo as contas em um separador magnético por 1-2 min.NOTA: Alternativamente, as esferas podem ser separadas por microcentrifugação a ≥8.000 × g por 1-2 min. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta das esferas imobilizadas ou peletizadas com ímã com o tubo ainda posicionado no separador magnético. Remova o tubo de microcentrífuga do ímã e adicione 80 μL de tampão de acoplamento (consulte a Tabela de materiais). Vórtice o tubo de reação suavemente e sonicate por 20 s para dispersar as contas. Ativar as contas com sulfo-NHS e EDC.NOTA: A solução-estoque de sulfo-NHS é de 50 mg/mL dissolvida em tampão de ativação. A solução-estoque de EDC também é 50 mg/mL dissolvida em tampão de ativação. Tanto o tampão de ativação quanto a umidade na atmosfera causam degradação do EDC. Não é aconselhável usar solução EDC armazenada. Faça apenas o suficiente de solução EDC fresca antes da etapa e use-a imediatamente quando a solução estiver pronta. Descarte o excesso de solução de EDC.CUIDADO: O EDC causa irritação ocular grave e é irritante do trato respiratório e da pele.Adicionar 10 μL de sulfo-NHS ao tubo de microfuga contendo as esferas lavadas e ativadas. Adicionar 10 μL de solução-mãe de EDC ao tubo de microfuga contendo as esferas e o sulfo-NHS. Proteger as microesferas fotossensíveis da luz e girar sobre o rotador por 20 min a 15-30 rpm, a TR (18-22 °C). Alternativamente, o tubo pode permanecer estacionário durante a etapa de ativação se for suavemente vórtice para redistribuir as contas em intervalos de 10 minutos. Lave o excesso de reagentes de acoplamento das contas.Coloque o tubo contendo as esferas ativadas em um separador magnético por 1-2 min. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de esferas imobilizadas ou peletizadas com ímã com o tubo ainda posicionado no separador magnético. Remova o tubo da microcentrífuga do ímã e adicione 100 μL de tampão de ativação. Vórtice o tubo de reação suavemente para dispersar as contas. Repita as etapas 2.6.1-2.6.4 duas vezes adicionais para um total de três lavagens. Ao final da lavagem, as esferas serão suspensas em 100 μL de tampão de ativação a uma concentração aproximada de 10 × 106 contas/mL. Junte o peptídeo rhPD-1 às esferas ativadas.Adicionar 390 μL de tampão de ativação ao tubo que contém as esferas ativadas para elevar o volume total da suspensão do cordão até 490 μL. Adicionar 1 μg de peptídeo PD-1 à suspensão de esferas ativadas adicionando 10 μL de solução peptídica PD-1 (1 mg/mL dissolvido em PBS) ao tubo contendo as esferas ativadas. Vórtice brevemente o tubo de microcentrífuga para distribuir uniformemente o PD-1 e as esferas ativadas. Incubar as esferas com PD-1 por 2 h no escuro em TR (18-22 °C) com rotação (15-30 rpm). Lavar as contas duas vezes (2x) usando Assay/Wash Buffer (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).Coloque o tubo contendo as esferas ativadas em um separador magnético por 1-2 min. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta das esferas imobilizadas ou peletizadas com ímã com o tubo ainda posicionado no separador magnético. Remova o tubo da microcentrífuga do ímã e adicione 100 μL de tampão de ativação. Vórtice o tubo de reação suavemente para dispersar as contas. Repita as etapas 2.8.1-2.8.4 uma vez adicional para um total de duas lavagens. Ao final da lavagem, as esferas serão suspensas em 100 μL de tampão de ativação na concentração de 10 × 106 contas/mL.NOTA: O tampão de ensaio/lavagem pode ser feito sem azida de sódio (conservante) se o tampão não for também usado como meio de armazenamento. Conservar as esferas acopladas a rhPD-1 no escuro no frigorífico a 2-8 °C se não for utilizado imediatamente. As esferas acopladas à proteína são estáveis por até 18 meses. 3. Avaliação do sucesso do acoplamento rhPD-1 às esferas NOTA: As microesferas acopladas a rhPD-1 reagem com rhPD-L1 biotinilado, sendo este último detectado por incubação com SAPE seguido de uma avaliação no citômetro de fluxo. Isso verifica tanto o acoplamento bem sucedido do PD-1 às esferas magnéticas quanto a interação funcional entre as proteínas rhPD-1 e rhPD-L1. Crie uma série de diluição em série de duas vezes de rhPD-L1 biotinilado em PBS-TBN (a solução de rhPD-L1 estoque é de 1 mg/mL). A faixa de concentração final de rhPD-L1 a ser testada é uma solução de 8 μg/mL até uma solução de 313 pg/mL. Crie volumes de 150 μL de cada diluição rhPD-L1: 50 μL para cada reação e duas reações por condição, além de excesso suficiente para acomodar perdas de pipetagem.Rotular os tubos de microfuge de diluição rhPD-L1 como 8 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,25 μg/mL, 0,125 μg/mL, 0,063 μg/mL e 0,031 μg/mL. Um tubo de 0 μg/mL (somente PBS-TBN) serve como controle sem PD-L1. Pré-carregar 150 μL de PBS-TBN para todos os tubos de diluição marcados com rhPD-L1.NOTA: A maior concentração final de rhPD-L1 a ser testada é de 8 μg/mL, e a rhPD-L1 será diluída 1:1 após a adição à mistura de reação, de modo que o tubo de diluição rotulado “8 μg/mL” refere-se à concentração final e realmente contém 16 μg/mL de rhPD-L1. Os rótulos de todos os tubos de diluição indicam a concentração final de rhPD-L1 após a adição à reação. Crie a diluição rhPD-L1 de maior concentração (16 μg/mL real). Trata-se de uma diluição em duas etapas e 62,5 vezes da solução-estoque de 1 mg/mL de rhPD-L1 (1.000 μg/16 μg = 62,5).Combinar 84 μL de PBS-TBN com 16 μL de solução-estoque de rhPD-L1 (1 mg/mL, ou seja, 1.000 μL) em um tubo de microcentrífuga. Trata-se de uma diluição de 6,25 vezes, e a concentração resultante é de 160 μg/mL rhPD-L1. No tubo marcado com “8 μg/mL”, combinar 270 μL de PBS-TBN com 30 μL da diluição rhPD-L1 criada na etapa anterior (160 μg/mL). Esta é uma diluição de 10 vezes, e a concentração resultante é na verdade 16 μg/mL. O rótulo do tubo “8 μg/mL” refere-se à sua concentração final após a adição à reação. Transferir 150 μL da diluição rhPD-L1 criada na etapa 3.1.3 (“8 μg/mL”) para o tubo de “4 μg/mL”, fechar a tampa do tubo da microcentrífuga e agitar brevemente o vórtice para misturar a solução. Repetir o passo 3.1.4 sequencialmente até completar a série de diluição rhPD-L1. Após a criação, todos os tubos entre “8 μg/mL” a “0,063 μg/mL”, assim como o controle 0 μg/mL, devem conter 150 μL de solução, e o último tubo, “0,031 μg/mL”, deve conter 300 μL de solução. Isso cria um volume suficiente de cada diluição para testar 50 μL de cada diluição rhPD-L1 biotinilada em reações duplicadas, com excesso suficiente restante para acomodar as perdas de pipetagem. Contagem das esferas acopladas a rhPD-1 utilizando hemocitômetro17. Diluir as esferas de estoque acopladas a rhPD-1 para 5 × 104 contas/mL, com volume suficiente para 2.500 contas/50 μL/reação. Vórtice a suspensão de 5 ×10 4 contas/mL de grânulos acoplados a rhPD-1 e pipetar 50 μL da suspensão em cada poço marcado/mapeado de uma placa de microtitulação de fundo redondo de 96 poços para que haja poços duplicados criados para cada diluição rhPD-L1 que está sendo testada. Adicionar 50 μL de cada tubo de diluição rhPD-L1 biotinilado criado na etapa 3.1 aos orifícios apropriados na placa de microtitulação. Cubra a placa de microtitulação com uma folha descartável ou seladora de placa adesiva plástica e incube a placa por 1 h no escuro em TR (18-22 °C) em um agitador orbital (600 rpm). Lave o excesso de rhPD-L1 biotinilado das contas.Transfira a placa selada do agitador orbital para o separador magnético de placas por 2 min para imobilizar as contas. Remova cuidadosamente o selador da placa adesiva, confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão firmemente juntos, inverta a placa e despeje os sobrenadantes em uma pia ou recipiente de resíduos líquidos de risco biológico, conforme apropriado. Bata suavemente, mas rapidamente, a placa invertida em uma almofada de tecido de papel absorvente para remover o sobrenadante restante. Remova a placa de microtitulação do separador magnético da placa e pipete 150 μL de PBS-TBN em cada poço. Coloque a placa não selada no separador magnético por 2 min para imobilizar as contas. Confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão firmemente juntos, inverta a placa e despeje os sobrenadantes em um recipiente de dissipação ou recipiente de resíduos líquidos de risco biológico, conforme apropriado. Bata suavemente, mas rapidamente, a placa invertida em uma almofada de tecido de papel absorvente para remover o sobrenadante restante. Repetir as etapas de lavagem da placa 3.7.3-3.7.5 duas vezes para um total de três lavagens com 150 μL de PBS-TBN cada. Certifique-se de que nenhum sobrenadante permaneça nos poços no final da última etapa de lavagem. Trabalhe firmemente para evitar a secagem das contas imobilizadas no fundo do poço. Adicione o SAPE Detection Reagent.Diluir a solução-mãe SAPE em PBS-TBN até uma concentração de trabalho de 6 μg/ml. Preparar um volume suficiente de solução de trabalho SAPE para que todos os poços de reação possam receber 100 μL/poço, com extra suficiente para acomodar perdas de pipetagem. Remova a placa de microtitulação do separador de placa magnética. Adicionar 100 μL de solução de trabalho SAPE em cada poço de reação e ressuspender as esferas lavadas por pipetagem. Sele a placa de microtitulação de 96 poços com um selador de folha ou placa adesiva plástica e incube por 1 h no escuro em RT (18-22 °C) em um agitador orbital a 600 rpm. Retirar a placa de microtitulação da incubadora, transferi-la para o separador magnético de placas para imobilizar as contas, remover o selador da placa adesiva e lavar as contas três vezes com 150 μL PBS-TBN, conforme descrito nas etapas 3.7.3-3.7.5. Após a remoção da lavagem final, remova a placa do separador magnético de placas e ressuspenda as esferas em 100 μL de PBS-TBN por poço. Analise os resultados.Leia a placa no instrumento de análise de fluxo (veja a Tabela de Materiais) para determinar a intensidade média de fluorescência (MFI) de cada reação usando as seguintes configurações do instrumento: volume de aspiração = 50 μL; contagem mínima de contas = 100 contas; configuração de tempo limite = 40 s; gating = 7.000-17.000; modo de operação = Repórter Único. Poços duplicados são executados para cada condição, e os dois valores de MFI de saída para cada condição são calculados em média antes de executar cálculos de dados adicionais e gráficos.NOTA: O valor de IFM de cada diluição deve mostrar ligação dependente da concentração, indicando eficiência aceitável de acoplamento rhPD-1 às esferas e confirmando boa interação das proteínas recombinantes PD-1/PD-L1. 4. PD-L1 ensaio de bloqueio PD-1/PD-L1 baseado em esferas magnéticas NOTA: Este ensaio avalia a atividade de bloqueio de mediadores solúveis (por exemplo, anticorpos anti-PDL1-peptídeo) em interações PD1/PD-L1 recombinantes. Resumidamente, rhPD-L1 biotinilado é pré-incubado com anticorpos gerados em coelhos após diferentes inoculações do peptídeo PDL1-Vaxx. A mistura de anticorpos rhPD-L1 + anti-PDL1 é então capturada usando esferas magnéticas acopladas a rhPD-1, e a ligação de rhPD-L1 às esferas acopladas a rhPD-1 é quantificada pela adição de estreptavidina-PE. O sinal de fluorescência do PE correlaciona-se inversamente com a atividade bloqueadora dos anticorpos/inibidores anti-PDL1 testados. A ligação do anticorpo anti-peptídeo PDL1 é avaliada simultaneamente pela ligação de um anticorpo secundário anti-coelho acoplado a BV421 (para anticorpos antipeptídeo anti-PDL1) ou anti-humano (para anticorpos de controle) e pela avaliação da fluorescência BV421 no segundo canal do instrumento. As etapas do ensaio estão pictoricamente detalhadas na Figura 1. Preparar uma série de diluição em série de duas vezes dos anticorpos de teste, incluindo candidatos a anticorpos policlonais induzidos por PDL1-Vaxx, um anticorpo de controle negativo (trastuzumabe, Herceptin, anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado) e um anticorpo de controle positivo (atezolizumabe; anticorpo monoclonal anti-PDL1 IgG1 humanizado). Cada reação usará 25 μL da diluição de anticorpos atribuída, de modo que os volumes mostrados sejam suficientes para realizar cada reação em poços duplicados por condição (ou seja, 50 μL por condição), com algum excesso restante para acomodar as perdas de pipetagem.Para cada anticorpo anti-PDL1-peptídeo induzido pela vacina e anticorpo de controle, certifique-se de que o intervalo das concentrações finais de anticorpos testadas seja de 1.000 μg/mL até 8 μg/mL. Preparar soluções-mãe de todos os anticorpos a 2.000 μg/mL. Para cada anticorpo, rotular os tubos de diluição como 1.000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 63 μg/mL, 31 μg/mL, 16 μg/mL e 8 μg/mL e incluir o nome do anticorpo. Para cada anticorpo, adicione também um tubo de “0 μg/mL”, que será o controle somente do veículo (PBS-TBN).NOTA: Quando adicionado à mistura de reação, a concentração de anticorpos será diluída 1:1. Os tubos de diluição de anticorpos são rotulados como a concentração final de anticorpos após a adição à reação e, na verdade, contêm o dobro da quantidade de anticorpos do que a marcada. Adicionar 75 μL de PBS-TBN a todos os tubos de diluição de anticorpos rotulados como “500 μg/mL” e abaixo, incluindo os tubos de controle somente para veículos “0 μg/mL”. Para cada anticorpo, pipetar 150 μL da solução-estoque de 2.000 μg/mL para o respectivo tubo rotulado como “1.000 μg/mL”. Isso será usado para fazer todas as diluições subsequentes para cada anticorpo. Para cada anticorpo, crie uma série completa de diluição transferindo 75 μL por pipeta do tubo de “1.000 μg/mL” para o tubo com a próxima diluição mais baixa da série (ou seja, “500 μg/mL”). Feche o tubo de diluição recém-concluído, vomite-o brevemente e continue a construção da série de diluição transferindo 75 μL do tubo de “500 μg/mL” para o tubo de “250 μg/mL”. Repita esse padrão até que a última diluição, “8 μg/mL”, tenha sido feita para todos os anticorpos.NOTA: Na série de diluição completa para cada anticorpo, deve haver um volume de 75 μL para todos os tubos, exceto a diluição mais baixa, 8 μg/mL, que deve conter um volume de 150 μL. Cada reação usará 25 μL de diluição de anticorpos, de modo que esses volumes sejam suficientes para realizar cada reação em poços duplicados por condição (ou seja, 50 μL por condição), com extra para acomodar as perdas de pipetagem. Colocar 25 μL dos anticorpos diluídos nos poços designados de uma placa de microtitulação de 96 poços. Diluir rhPD-L1 biotinilado para uma concentração de trabalho de 4 μg/mL em PBS-TBN em um volume suficiente para incluir 25 μL em poços duplicados por condição (ou seja, 50 μL por condição), com extra para acomodar perdas de pipetagem.NOTA: Neste trabalho, rhPD-L1 biotinilado a 4 μg/mL resultou em aproximadamente 50% do sinal de IFM máximo medido na avaliação anterior do acoplamento e foi usado para a análise do bloqueio PD-1/PD-L1. Adicionar 25 μL de rhPD-L1 biotinilado (4 μg/mL) a cada poço de reação, cobrir a placa de microtitulação com uma folha ou selo adesivo plástico e incubar em RT (18-22 °C) por 1 h com agitação em um agitador de placa orbital a 600 rpm. Diluir as esferas acopladas a rhPD-1 para 50.000 contas/mL, com um volume suficiente para 50 μL/poço (2.500 contas/poço) mais extra para acomodar as perdas de pipetagem. Remova a placa de reação de microtitulação de 96 poços do agitador e remova o selo da placa adesiva. Adicionar 50 μL da mistura de esferas acoplada a rhPD-1 a cada poço. Sele a placa e incube por 1 h no escuro em TR (18-22 °C) em um agitador orbital a 600 rpm. Transfira a placa selada do agitador orbital para o separador magnético de placas por 2 min para imobilizar as contas. Remova cuidadosamente o selador da placa adesiva, confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão firmemente juntos, inverta a placa e despeje os sobrenadantes. Bata suavemente a placa invertida em uma almofada de papel absorvente para remover o excesso de sobrenadante. Lave o excesso de reagentes de reação das contas.Remova a placa de microtitulação do separador de placa magnética e adicione 150 μL de PBS-TBN a cada poço. Coloque a placa de microtitulação no separador magnético de placas por 2 min para imobilizar as contas. Confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão firmemente juntos, inverta a placa e despeje os sobrenadantes. Bata suavemente a placa invertida em uma almofada de papel absorvente para remover o excesso de sobrenadante. Repetir as etapas de lavagem da placa 4.11.1-4.11.3 duas vezes, totalizando três lavagens com PBS-TBN. Certifique-se de que o reagente SAPE está preparado (abaixo) antes de remover a solução de lavagem final (terceira). Adicione o reagente de detecção SAPE.Diluir a solução-mãe SAPE para uma concentração de trabalho de 6 μg/mL em PBS-TBN; fazer um volume suficiente para 100 μL/poço, além de extra para acomodar perdas de pipetagem. Adicione 100 μL/poço da solução de trabalho SAPE em cada poço de reação e ressuspenda as esferas por pipetagem. Sele a placa e incube por 1 h no escuro em TR (18-22 °C) em um agitador orbital a 600 rpm. Decantar o excesso de SAPE da reação.Transfira a placa selada do agitador orbital para o separador magnético de placas por 2 min para imobilizar as contas. Remova cuidadosamente o selador da placa adesiva, confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão firmemente juntos, inverta a placa e despeje o sobrenadante. Bata suavemente a placa invertida em uma almofada de tecido de papel absorvente para remover o sobrenadante que contém o excesso de SAPE. Lave o excesso de SAPE das contas.Remova a placa de microtitulação do suporte da placa magnética. Adicionar 150 μL de PBS-TBN a cada poço para ressuspender as contas. Coloque a placa de microtitulação no separador magnético de placas por 2 min para imobilizar as contas. Confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão bem juntos, inverta a placa e despeje o sobrenadante. Bata suavemente a placa invertida em uma almofada de papel absorvente para remover o excesso de sobrenadante. Execute duas etapas de lavagem adicionais com PBS-TBN para um total de três lavagens repetindo as etapas 4.15.1-4.15.4. Preparar os anticorpos de detecção secundária congugados com BV421 (próxima etapa) antes de remover a solução de lavagem final (terceira). Adicione os anticorpos secundários congugados com BV421.IgG anti-humano congugiada com BV421 diluída (para detecção de anticorpos de controle humanizados) e IgG anti-coelho congugada com BV421 (para detecção de anticorpos policlonais induzidos por PDL1-Vaxx) (ver Tabela de Materiais) 1:400 em tampão de lavagem/ensaio em volumes suficientes para usar 100 μL/poço de cada, com extra para acomodar perdas de pipetagem. Adicionar 100 μL de IgG anti-humano conjugada com BV421 diluída ou IgG anti-coelho conjugada com BV421 aos poços apropriados. Sele a placa e incube por 1 h no escuro em TR (18-22 °C) em um agitador orbital a 600 rpm. Decantar o excesso de anticorpos secundários conjugados com BV421 das contas.Transfira a placa selada do agitador orbital para o separador magnético de placas por 2 min para imobilizar as contas. Remova cuidadosamente o selador da placa adesiva, confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão firmemente juntos, inverta a placa e despeje o sobrenadante. Bata suavemente a placa invertida em uma almofada de tecido de papel absorvente para remover o sobrenadante que contém excesso de anticorpos secundários conjugados com BV421. Lave o excesso de anticorpos secundários conjugados com BV421 das contas.Adicionar 150 μL de PBS-TBN a cada poço para ressuspender as contas. Coloque a placa de microtitulação no separador magnético de placas por 2 min para imobilizar as contas. Confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão bem juntos, inverta a placa e despeje o sobrenadante. Bata suavemente a placa invertida em uma almofada de papel absorvente para remover o excesso de sobrenadante. Execute três etapas de lavagem adicionais com PBS-TBN para um total de quatro lavagens repetindo as etapas 4.19.1-4.19.3. Após a remoção do último (quarto) tampão de lavagem, remova a placa de microtitulação do separador magnético de placas e ressuspenda as esferas em 100 μL PBS-TBN/poço com um pipetador. Analise os resultados.Leia a placa no sistema de análise de fluxo dual-reporter para determinar a MFI de cada reação usando as seguintes configurações do instrumento: volume de aspiração = 50 μL; contagem mínima de contas = 100 contas; configuração de tempo limite = 40 s; gating: 7.000-17.000; modo de operação = Dual Reporter. Com o sistema dual-reporter, certifique-se de que o Reporter Channel 1 mede a fluorescência de PE laranja (quantidade de rhPD-L1 anexada a esferas conjugadas a rhPD-1) e o Reporter Channel 2 mede a fluorescência BV421 azul (quantidade de anticorpo bloqueador ligado a rhPD-L1). Execute poços duplicados para cada condição e faça a média dos dois valores de MFI de saída para cada condição antes de executar cálculos e gráficos de dados adicionais. Padronizar o valor de IFM de cada amostra para o controle negativo e calcular a porcentagem de inibição para cada amostra:Inibição% = (100 × [MFI de controle negativo − MFI de amostra])/MFI de controle negativoNOTA: Os valores de IFM de controlo negativo (sem inibição) são os valores mais elevados; o sinal ligado PD-L1 MFI é de 100%, e a inibição da ligação de rhPD-L1 a rhPD-1 é definida como 0%. Figura 1: Esquema do ensaio de bloqueio PD-1/PD-L1 do repórter duplo. A PD-L1 humana recombinante biotinilada (rhPD-L1) é pré-incubada com anticorpos anti-PDL1 induzidos por PDL1-Vaxx selecionados antes de se combinar com esferas magnéticas acopladas a rhPD-1 para permitir a formação do complexo de pontos de verificação PD-1/PD-L1. A rhPD-L1 complexada é então detectada e marcada pela adição de ficoeritrina acoplada à estreptavidina (SAPE, fluoróforo de laranja). Os anticorpos contra os epítopos PDL1-Vaxx têm como alvo o rhPD-L1 que se complexou ao rhPD-1 pré-acoplado às esferas magnéticas, e eles são iluminados usando um anticorpo secundário conjugado Brilliant Violet 421 (BV421, fluoróforo azul). Tanto os anticorpos rhPD-L1 biotinilados que são complexados a PD-1 (sinal de PE) quanto os anticorpos anti-PDL1 que reconhecem e se ligam ao rhPD-L1 (sinal BV421) são analisados simultaneamente usando um instrumento de citometria de fluxo de repórter duplo que interroga amostras para ambos os fluoróforos em dois canais repórteres separados. Os valores de saída para cada amostra são a intensidade mediana da fluorescência de cada fluoróforo. A inibição da formação do complexo PD1/PD-L1 por diferentes anticorpos induzidos por PDL1-Vaxx é então extrapolada comparando-se os sinais experimentais com aqueles gerados usando um anticorpo monoclonal de controle negativo que não se liga a rhPD-L1 (0% de inibição). 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