Analisi del flusso a doppio reporter basata su biglie fluorescenti magnetiche del blocco anticorpale indotto dal peptide PDL1-Vaxx dell'interazione PD-1/PD-L1

1. Preparazione sperimentale NOTA: I dettagli di tutti i reagenti/apparecchiature menzionati in questo passaggio sono elencati nella Tabella dei materiali. Ottenere PD-1 umano ricombinante (rhPD-1; poliistidina-marcato). Ricostituire rhPD1 liofilizzato con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) filtrata sterile, pH 7,4, prima dell’uso. Ottenere PD-L1 umano ricombinante biotinilato (rhPD-L1). Ricostituire rhPD-L1 liofilizzato con acqua deionizzata sterile prima dell’uso. Ottenere il reagente per la rilevazione della R-ficoeritrina coniugato con streptavidina (SAPE). Conservare tutte le soluzioni SAPE al riparo dalla luce a temperature di frigorifero (es. 2-8 °C). Ottenere microsfere magnetiche colorate in fluorescenza (diametro 6,5 μm, polistirene con magnetite incorporata) e il Kit di Accoppiamento Perline15 (se utilizzato, vedere la Tabella dei Materiali). L’accoppiamento covalente alle microsfere richiede solfo-NHS (sulfo-N-idrosuccinimide) e EDC (N-[3-dimetilamminopropil]-N′-etilcarbodiimmide cloridrato).NOTA: I set di perline magnetiche sono disponibili con uno qualsiasi dei 500 tag fluorescenti unici, che consentono l’identificazione e la differenziazione da diversi set di perline16. Le perle sono disponibili in concentrazioni standard di 2,5 × 10,6 perline/mL e 12,5 × 10,6 perline/mL. Conservare le perle al riparo dalla luce a temperature di frigorifero (es. 2-8 °C). Non congelare le sospensioni del tallone. Ottenere anticorpi di controllo positivi e negativi e anticorpi di rilevamento secondario marcati con Brilliant Violet 421 (BV421). Conservare tutte le molecole coniugate fluorescenti al riparo dalla luce. Eseguire tutte le reazioni di accoppiamento in provette a basso legame proteico e tutte le reazioni di saggio in piastre per microtitolazione a basso legame proteico, a fondo tondo, a 96 pozzetti. Sigillare le piastre con una pellicola adesiva monouso o coperchi per micropiastre in plastica a 96 pozzetti per le fasi di incubazione del saggio. Utilizzare un separatore magnetico a piastre per immobilizzare le perle durante le fasi di lavaggio del saggio.NOTA: Il sistema di analisi del flusso a doppio reporter è dotato di tre laser: (1) uno che identifica e quantifica la fluorescenza specifica del set di microsfere (canale di classificazione); (2) uno che rileva e quantifica la fluorescenza della ficoeritrina (PE) bersaglio-specifica (Reporter Channel 1; eccitazione 532 nm, emissione “arancione” 565-585 nm); e (3) uno che rileva e quantifica la fluorescenza BV421 target-specifica di un secondo analita target (Reporter Channel 2; eccitazione 405 nm, emissione “blu” 421-441 nm). 2. Accoppiamento di rhPD-1 a perline magnetiche NOTA: La proteina da accoppiare deve essere priva di albumina sierica bovina (BSA), azoturo di sodio, glicina, glicerolo, tris(idrossi-metil)amminometano (Tris) o additivi contenenti ammine e deve essere sospesa in PBS a pH 7,4. È disponibile un kit di accoppiamento commerciale che include tutti i reagenti e i tamponi necessari descritti nel presente documento (vedere la tabella dei materiali). Rimuovere tutti i reagenti di accoppiamento dal frigorifero e lasciarli equilibrare a temperatura ambiente (RT, 18-22 °C) per 20-30 min. Risospendere le microsfere di serie mediante un breve vortice, sonicazione o rotazione (15 minuti a 15-30 giri/min), secondo la scheda informativa del prodotto. Trasferire 1 × 106 microsfere magnetiche in una provetta per microcentrifuga a basso legame proteico da 1,5 mL (vedere la tabella dei materiali). Microsfere di lavaggio con 100 μL di tampone di attivazione15: 0,1 M NaH2PO4 (monobasico), pH 6,2.NOTA: L’accoppiamento può essere eseguito anche utilizzando un kit di accoppiamento preconfigurato, che include acido 2-morfolinoetanosolfonico (MES) 0,1 M, pH 6,0, come tampone alternativo di attivazione e accoppiamento (vedere la Tabella dei materiali).Mettere la provetta contenente le perline in un separatore magnetico per 1-2 minuti.NOTA: In alternativa, le perle possono essere separate mediante microcentrifugazione a ≥8.000 × g per 1-2 min. Aspirare il surnatante con una pipetta dalle microsfere immobilizzate o pellettate con la provetta ancora posizionata nel separatore magnetico. Rimuovere la provetta per microcentrifuga dal magnete e aggiungere 80 μL di tampone di accoppiamento (vedere la tabella dei materiali). Agitare delicatamente il tubo di reazione e sonicare per 20 secondi per disperdere le perle. Attivare le perle con sulfo-NHS e EDC.NOTA: La soluzione madre di sulfo-NHS è di 50 mg/mL disciolta nel tampone di attivazione. La soluzione madre di EDC è anche 50 mg/mL disciolti nel tampone di attivazione. Sia il tampone di attivazione che l’umidità nell’atmosfera causano la degradazione dell’EDC. Non è consigliabile utilizzare una soluzione EDC immagazzinata. Prepara una soluzione EDC fresca quanto basta prima del passaggio e usala immediatamente quando la soluzione è pronta. Scartare la soluzione EDC in eccesso.ATTENZIONE: L’EDC provoca grave irritazione oculare ed è irritante per le vie respiratorie e la pelle.Aggiungere 10 μL di sulfo-NHS alla provetta microfugo contenente le perle lavate e attivate. Aggiungere 10 μL di soluzione madre EDC alla provetta microfuge contenente le microsfere e il sulfo-NHS. Proteggere le microsfere fotosensibili dalla luce e ruotare sul rotatore per 20 min a 15-30 giri/min, a RT (18-22 °C). In alternativa, il tubo può rimanere fermo durante la fase di attivazione se viene delicatamente vorticato per ridistribuire le perline a intervalli di 10 minuti. Lavare via i reagenti di accoppiamento in eccesso dalle perle.Posizionare la provetta contenente le perle attivate in un separatore magnetico per 1-2 minuti. Aspirare il surnatante con una pipetta da microsfere immobilizzate o pellettate con il tubo ancora posizionato nel separatore magnetico. Rimuovere la provetta per microcentrifuga dal magnete e aggiungere 100 μL di tampone di attivazione. Agitare delicatamente il tubo di reazione per disperdere le perle. Ripetere i passaggi 2.6.1-2.6.4 altre due volte per un totale di tre lavaggi. Al termine del lavaggio, le perle saranno sospese in 100 μL di tampone di attivazione ad una concentrazione approssimativa di 10 × 106 perline/mL. Accoppiare il peptide rhPD-1 alle perle attivate.Aggiungere 390 μL di tampone di attivazione alla provetta contenente le perle attivate per portare il volume totale della sospensione delle microsfere a 490 μL. Aggiungere 1 μg di peptide PD-1 alla sospensione di microsfere attivate aggiungendo 10 μL di soluzione di peptide PD-1 (1 mg/mL disciolto in PBS) alla provetta contenente le perle attivate. Ruotare brevemente la provetta per microcentrifuga per distribuire uniformemente il PD-1 e le perle attivate. Incubare le perle con PD-1 per 2 ore al buio a RT (18-22 °C) con rotazione (15-30 giri/min). Lavare le perle due volte (2x) utilizzando il tampone di saggio/lavaggio (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).Posizionare la provetta contenente le perle attivate in un separatore magnetico per 1-2 minuti. Aspirare il surnatante con una pipetta dalle microsfere immobilizzate o pellettate con la provetta ancora posizionata nel separatore magnetico. Rimuovere la provetta per microcentrifuga dal magnete e aggiungere 100 μL di tampone di attivazione. Agitare delicatamente il tubo di reazione per disperdere le perle. Ripetere i passaggi 2.8.1-2.8.4 un’altra volta per un totale di due lavaggi. Al termine del lavaggio, le microsfere saranno sospese in 100 μL di tampone di attivazione ad una concentrazione di 10 × 106 perline/mL.NOTA: Il tampone di saggio/lavaggio può essere prodotto senza azoturo di sodio (conservante) se il tampone non viene utilizzato anche come mezzo di conservazione. Conservare le perline accoppiate rhPD-1 al buio in frigorifero a 2-8 °C se non utilizzate immediatamente. Le perle accoppiate a proteine sono stabili fino a 18 mesi. 3. Valutazione del successo dell’accoppiamento rhPD-1 alle perline NOTA: Le microsfere accoppiate a rhPD-1 vengono fatte reagire con rhPD-L1 biotinilato, l’ultimo dei quali viene rilevato mediante incubazione con SAPE seguita da una valutazione sul citometro a flusso. Ciò verifica sia il successo dell’accoppiamento di PD-1 alle biglie magnetiche sia l’interazione funzionale tra le proteine rhPD-1 e rhPD-L1. Creare una serie di diluizioni seriali doppie di rhPD-L1 biotinilato in PBS-TBN (la soluzione madre di rhPD-L1 è 1 mg/mL). L’intervallo di concentrazione finale di rhPD-L1 da testare è una soluzione da 8 μg/mL fino a una soluzione da 313 pg/mL. Creare volumi da 150 μL di ciascuna diluizione rhPD-L1: 50 μL per ogni reazione e due reazioni per condizione, più un eccesso sufficiente per compensare le perdite di pipettaggio.Etichettare le provette per microfugo di diluizione rhPD-L1 come 8 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,25 μg/mL, 0,125 μg/mL, 0,063 μg/mL e 0,031 μg/mL. Una provetta da 0 μg/mL (solo PBS-TBN) funge da controllo no-PD-L1. Precaricare 150 μL di PBS-TBN su tutte le provette di diluizione rhPD-L1 etichettate.NOTA: La concentrazione finale più alta di rhPD-L1 da testare è di 8 μg/mL e rhPD-L1 verrà diluito 1:1 al momento dell’aggiunta alla miscela di reazione, quindi la provetta di diluizione etichettata “8 μg/mL” si riferisce alla concentrazione finale e contiene effettivamente 16 μg/mL rhPD-L1. Le etichette su tutte le provette di diluizione indicano la concentrazione finale di rhPD-L1 dopo l’aggiunta alla reazione. Creare la diluizione rhPD-L1 a più alta concentrazione (16 μg/mL effettivi). Si tratta di una diluizione in due fasi, 62,5 volte, della soluzione madre rhPD-L1 da 1 mg/mL (1.000 μg/16 μg = 62,5).Combinare 84 μL di PBS-TBN con 16 μL di soluzione madre rhPD-L1 (1 mg/mL, cioè 1.000 μL) in una provetta per microcentrifuga. Si tratta di una diluizione di 6,25 volte e la concentrazione risultante è di 160 μg/mL rhPD-L1. Nella provetta etichettata “8 μg/mL”, combinare 270 μL di PBS-TBN con 30 μL della diluizione rhPD-L1 creata nella fase precedente (160 μg/mL). Si tratta di una diluizione di 10 volte e la concentrazione risultante è in realtà di 16 μg/mL. L’etichetta della provetta “8 μg/mL” si riferisce alla sua concentrazione finale dopo l’aggiunta alla reazione. Trasferire 150 μL della diluizione rhPD-L1 creata al punto 3.1.3 (“8 μg/mL”) nella provetta “4 μg/mL”, chiudere il tappo della provetta per microcentrifuga e vorticare brevemente per miscelare la soluzione. Ripetere il passaggio 3.1.4 in sequenza fino al completamento della serie di diluizioni rhPD-L1. Dopo la creazione, tutte le provette comprese tra “8 μg/mL” e “0,063 μg/mL”, così come il controllo 0 μg/mL, devono contenere 150 μL di soluzione e l’ultima provetta, “0,031 μg/mL”, deve contenere 300 μL di soluzione. In questo modo si crea un volume sufficiente di ciascuna diluizione per testare 50 μL di ciascuna diluizione di rhPD-L1 biotinilato in reazioni duplicate, con un eccesso sufficiente a compensare le perdite di pipettaggio. Contare le perline accoppiate a rhPD-1 usando un emocitometro17. Diluire le perle accoppiate a rhPD-1 a 5 × 104 perline/mL, con un volume sufficiente per 2.500 perline/50 μL/reazione. Ruotare la sospensione a microsfere accoppiate rhPD-1 da 5 × 104 microsfere/mL e pipettare 50 μL della sospensione in ciascun pozzetto marcato/mappato di una piastra per microtitolazione a fondo tondo a 96 pozzetti in modo da creare pozzetti duplicati per ogni diluizione rhPD-L1 in fase di test. Aggiungere 50 μL di ciascuna provetta di diluizione rhPD-L1 biotinilata creata nella fase 3.1 nei pozzetti appropriati sulla piastra per microtitolazione. Coprire la piastra per microtitolazione con un foglio monouso o un sigillante adesivo in plastica e incubare la piastra per 1 ora al buio a RT (18-22 °C) su un agitatore orbitale (600 giri/min). Lavare l’eccesso di rhPD-L1 biotinilato dalle perline.Trasferire la piastra sigillata dall’agitatore orbitale al separatore magnetico per piastre per 2 minuti per immobilizzare le perline. Rimuovere con cautela il sigillante per piastre adesive, verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano saldamente insieme, capovolgere la piastra e scaricare i surnatanti in un lavandino o in un contenitore per rifiuti liquidi a rischio biologico, a seconda dei casi. Picchiettare delicatamente ma energicamente la piastra capovolta su un cuscino di carta assorbente per rimuovere il surnatante rimanente. Rimuovere la piastra per microtitolazione dal separatore magnetico a piastre e pipettare 150 μL di PBS-TBN in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra non sigillata sul separatore magnetico per 2 minuti per immobilizzare le perline. Verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano saldamente uniti, quindi capovolgere la piastra e scaricare i surnatanti in un lavandino o in un contenitore per rifiuti liquidi a rischio biologico, a seconda dei casi. Picchiettare delicatamente ma energicamente la piastra capovolta su un cuscino di carta assorbente per rimuovere il surnatante rimanente. Ripetere le fasi di lavaggio delle lastre 3.7.3-3.7.5 due volte per un totale di tre lavaggi con 150 μL di PBS-TBN ciascuno. Assicurarsi che non rimanga alcun surnatante nei pozzetti alla fine dell’ultima fase di lavaggio. Lavorare costantemente per evitare che le perline immobilizzate si secchino sul fondo del pozzo. Aggiungere il reagente di rilevamento SAPE.Diluire la soluzione madre SAPE in PBS-TBN a una concentrazione di lavoro di 6 μg/mL. Preparare un volume sufficiente di soluzione di lavoro SAPE in modo che tutti i pozzetti di reazione possano ricevere 100 μL/pozzetto, con un extra sufficiente per sopportare le perdite di pipettaggio. Rimuovere la piastra per microtitolazione dal separatore magnetico per piastre. Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro SAPE in ciascun pozzetto di reazione e risospendere le microsfere lavate mediante pipettaggio. Sigillare la piastra per microtitolazione a 96 pozzetti con un sigillante per piastre adesive in alluminio o plastica e incubare per 1 ora al buio a RT (18-22 °C) su un agitatore orbitale a 600 giri/min. Rimuovere la piastra per microtitolazione dall’incubatore, trasferirla nel separatore magnetico per piastre per immobilizzare le sfere, rimuovere il sigillante per piastre adesive e lavare le microsfere tre volte con 150 μL PBS-TBN, come descritto nei passaggi 3.7.3-3.7.5. Dopo aver rimosso il lavaggio finale, rimuovere la piastra dal separatore magnetico a piastre e risospendere le microsfere in 100 μL di PBS-TBN per pozzetto. Analizza i risultati.Leggere la targhetta sullo strumento di analisi del flusso (vedere la Tabella dei materiali) per determinare l’intensità mediana della fluorescenza (MFI) di ciascuna reazione utilizzando le seguenti impostazioni dello strumento: volume di aspirazione = 50 μL; numero minimo di perline = 100 perline; impostazione timeout = 40 s; gating = 7.000-17.000; modalità di funzionamento = Single Reporter. Vengono eseguiti pozzetti duplicati per ogni condizione e viene calcolata la media dei due valori MFI di output per ciascuna condizione prima di eseguire ulteriori calcoli e grafici dei dati.NOTA: Il valore MFI di ciascuna diluizione deve mostrare un legame dipendente dalla concentrazione, indicando un’efficienza di accoppiamento rhPD-1 accettabile alle perle e confermando una buona interazione delle proteine ricombinanti PD-1/PD-L1. 4. Saggio di blocco PD-1/PD-L1 basato su microsfere magnetiche PD-L1 NOTA: Questo test valuta l’attività bloccante dei mediatori solubili (ad esempio, anticorpi anti-PDL1-peptidici) sulle interazioni ricombinanti PD1/PD-L1. In breve, rhPD-L1 biotinilato viene preincubato con anticorpi generati nei conigli dopo diverse inoculazioni di peptidi PDL1-Vaxx. La miscela di anticorpi rhPD-L1 + anti-PDL1 viene quindi catturata utilizzando microsfere magnetiche accoppiate a rhPD-1 e il legame di rhPD-L1 alle perle accoppiate a rhPD-1 viene quantificato mediante l’aggiunta di streptavidina-PE. Il segnale di fluorescenza PE è inversamente correlato con l’attività bloccante degli anticorpi/inibitori anti-PDL1 testati. Il legame dell’anticorpo anti-PDL1-peptide viene simultaneamente valutato mediante il legame di un anticorpo secondario anti-coniglio accoppiato a BV421 (per gli anticorpi anti-peptide PDL1) o anti-umano (per gli anticorpi di controllo) e valutando la fluorescenza BV421 nel secondo canale dello strumento. Le fasi del saggio sono illustrate in dettaglio nella Figura 1. Preparare una doppia serie di diluizioni seriali degli anticorpi del test, inclusi candidati anticorpi policlonali indotti da PDL1-Vaxx, un anticorpo di controllo negativo (trastuzumab, Herceptin, anticorpo monoclonale anti-HER2 umanizzato) e un anticorpo di controllo positivo (atezolizumab; anticorpo monoclonale umanizzato anti-PDL1 IgG1). Ogni reazione utilizzerà 25 μL della diluizione dell’anticorpo assegnata, quindi i volumi indicati sono sufficienti per eseguire ogni reazione in pozzetti duplicati per condizione (cioè 50 μL per condizione), con un po’ di eccesso rimanente per compensare le perdite di pipettaggio.Per ciascun anticorpo anti-peptide PDL1 indotto dal vaccino e anticorpo di controllo, assicurarsi che l’intervallo delle concentrazioni finali di anticorpi testate sia compreso tra 1.000 μg/mL e 8 μg/mL. Preparare le soluzioni madre di tutti gli anticorpi a 2.000 μg/mL. Per ciascun anticorpo, etichettare le provette di diluizione come 1.000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 63 μg/mL, 31 μg/mL, 16 μg/mL e 8 μg/mL e includere il nome dell’anticorpo. Per ogni anticorpo, aggiungere anche una provetta “0 μg/mL”, che sarà il controllo solo per il veicolo (PBS-TBN).NOTA: Quando viene aggiunto alla miscela di reazione, la concentrazione di anticorpi sarà diluita 1:1. Le provette di diluizione dell’anticorpo sono etichettate come concentrazione finale di anticorpi dopo l’aggiunta alla reazione e contengono effettivamente il doppio della quantità di anticorpo rispetto a quella etichettata. Aggiungere 75 μL di PBS-TBN a tutte le provette di diluizione degli anticorpi etichettate “500 μg/mL” e inferiori, comprese le provette di controllo “0 μg/mL” solo per veicoli. Per ciascun anticorpo, pipettare 150 μL della soluzione madre da 2.000 μg/mL nella rispettiva provetta etichettata “1.000 μg/mL”. Questo verrà utilizzato per effettuare tutte le successive diluizioni per ciascun anticorpo. Per ciascun anticorpo, creare una serie completa di diluizioni trasferendo con una pipetta 75 μL dalla provetta “1.000 μg/mL” alla provetta con la diluizione immediatamente inferiore della serie (cioè “500 μg/mL”). Chiudere la provetta di diluizione appena completata, farla vorticare brevemente e continuare la costruzione della serie di diluizione trasferendo 75 μL dalla provetta “500 μg/mL” alla provetta “250 μg/mL”. Ripetere questo schema fino a quando non è stata effettuata l’ultima diluizione, “8 μg/mL”, per tutti gli anticorpi.NOTA: Nella serie di diluizione completa per ciascun anticorpo, deve esserci un volume di 75 μL per tutte le provette ad eccezione della diluizione più bassa, 8 μg/mL, che deve contenere un volume di 150 μL. Ogni reazione utilizzerà 25 μL di diluizione dell’anticorpo, quindi questi volumi sono sufficienti per eseguire ogni reazione in pozzetti duplicati per condizione (cioè 50 μL per condizione), con un extra per adattarsi alle perdite di pipettaggio. Inserire 25 μL degli anticorpi diluiti nei pozzetti designati di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Diluire rhPD-L1 biotinilato a una concentrazione di lavoro di 4 μg/mL in PBS-TBN a un volume sufficiente a includere 25 μL in pozzetti duplicati per condizione (cioè 50 μL per condizione), con un extra per compensare le perdite di pipettaggio.NOTA: In questo lavoro, rhPD-L1 biotinilato a 4 μg/mL ha prodotto circa il 50% del segnale MFI massimo misurato nella precedente valutazione dell’accoppiamento ed è stato utilizzato per l’analisi del blocco PD-1/PD-L1. Aggiungere 25 μL di rhPD-L1 biotinilato (4 μg/mL) a ciascun pozzetto di reazione, coprire la piastra per microtitolazione con un sigillo adesivo in lamina o plastica e incubare a RT (18-22 °C) per 1 ora agitando su un agitatore orbitale a 600 giri/min. Diluire le microsfere accoppiate a rhPD-1 a 50.000 microsfere/mL, con un volume sufficiente per 50 μL/pozzetto (2.500 microsfere/pozzetto) più un extra per compensare le perdite di pipettaggio. Rimuovere la piastra di reazione per microtitolazione a 96 pozzetti dall’agitatore e rimuovere la guarnizione della piastra adesiva. Aggiungere 50 μL della miscela di microsfere accoppiate rhPD-1 a ciascun pozzetto. Sigillare la piastra e incubare per 1 ora al buio a RT (18-22 °C) su un agitatore orbitale a 600 giri/min. Trasferire la piastra sigillata dall’agitatore orbitale al separatore magnetico per piastre per 2 minuti per immobilizzare le perline. Rimuovere con cautela il sigillante per piastre adesive, verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano saldamente insieme, capovolgere la piastra e scaricare i surnatanti. Picchiettare delicatamente la piastra capovolta su un cuscino di carta assorbente per rimuovere il surnatante in eccesso. Lavare i reagenti di reazione in eccesso dalle perle.Rimuovere la piastra per microtitolazione dal separatore magnetico a piastre e aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra per microtitolazione sul separatore magnetico per piastre per 2 minuti per immobilizzare le perle. Verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano saldamente uniti, quindi capovolgere la piastra e scaricare i surnatanti. Picchiettare delicatamente la piastra capovolta su un cuscino di carta assorbente per rimuovere il surnatante in eccesso. Ripetere due volte le fasi di lavaggio delle lastre 4.11.1-4.11.3, per un totale di tre lavaggi con PBS-TBN. Assicurarsi che il reagente SAPE sia preparato (sotto) prima di rimuovere l’ultima (terza) soluzione di lavaggio. Aggiungere il reagente di rilevamento SAPE.Diluire la soluzione madre SAPE ad una concentrazione di lavoro di 6 μg/mL in PBS-TBN; creare un volume sufficiente per 100 μL/pozzetto, più un volume aggiuntivo per compensare le perdite di pipettaggio. Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione di lavoro SAPE in ciascun pozzetto di reazione e risospendere le microsfere mediante pipettaggio. Sigillare la piastra e incubare per 1 ora al buio a RT (18-22 °C) su un agitatore orbitale a 600 giri/min. Decantare la SAPE in eccesso dalla reazione.Trasferire la piastra sigillata dall’agitatore orbitale al separatore magnetico per piastre per 2 minuti per immobilizzare le perline. Rimuovere con cautela il sigillante adesivo della piastra, verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano saldamente insieme, quindi capovolgere la piastra e scaricare il surnatante. Picchiettare delicatamente la piastra capovolta su un cuscino di carta assorbente per rimuovere il surnatante contenente SAPE in eccesso. Lavare via il SAPE in eccesso dalle perline.Rimuovere la piastra per microtitolazione dal supporto per piastra magnetica. Aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzetto per risospendere le perle. Posizionare la piastra per microtitolazione sul separatore magnetico per piastre per 2 minuti per immobilizzare le perle. Verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano saldamente uniti, quindi capovolgere la piastra e scaricare il surnatante. Picchiettare delicatamente la piastra capovolta su un cuscino di carta assorbente per rimuovere il surnatante in eccesso. Eseguire due ulteriori fasi di lavaggio con PBS-TBN per un totale di tre lavaggi ripetendo i passaggi 4.15.1-4.15.4. Preparare gli anticorpi di rilevamento secondario con BV421 (passaggio successivo) prima di rimuovere la soluzione di lavaggio finale (terza). Aggiungere gli anticorpi secondari BG421-congugati.Diluire le IgG anti-umane congugate BV421 (per la rilevazione di anticorpi di controllo umanizzati) e le IgG anti-coniglio congugate BV421 (per la rilevazione di anticorpi policlonali indotti da PDL1-Vaxx) (vedere la tabella dei materiali) 1:400 in tampone di lavaggio/saggio a volumi sufficienti per l’utilizzo di 100 μL/pozzetto di ciascuno, con un supplemento per compensare le perdite di pipettaggio. Aggiungere 100 μL di IgG anti-umano coniugate BV421-diluite o IgG anti-coniglio coniugate BV421 nei pozzetti appropriati. Sigillare la piastra e incubare per 1 ora al buio a RT (18-22 °C) su un agitatore orbitale a 600 giri/min. Decantare gli anticorpi secondari coniugati BV421 in eccesso dalle perline.Trasferire la piastra sigillata dall’agitatore orbitale al separatore magnetico per piastre per 2 minuti per immobilizzare le perline. Rimuovere con cautela il sigillante adesivo della piastra, verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano saldamente insieme, quindi capovolgere la piastra e scaricare il surnatante. Picchiettare delicatamente la piastra capovolta su un cuscino di carta assorbente per rimuovere il surnatante contenente gli anticorpi secondari coniugati BV421 in eccesso. Lavare gli anticorpi secondari coniugati BV421 in eccesso dalle perle.Aggiungere 150 μL di PBS-TBN a ciascun pozzetto per risospendere le perle. Posizionare la piastra per microtitolazione sul separatore magnetico per piastre per 2 minuti per immobilizzare le perle. Verificare che il magnete e la piastra per microtitolazione siano saldamente uniti, quindi capovolgere la piastra e scaricare il surnatante. Picchiettare delicatamente la piastra capovolta su un cuscino di carta assorbente per rimuovere il surnatante in eccesso. Eseguire tre ulteriori fasi di lavaggio con PBS-TBN per un totale di quattro lavaggi ripetendo i passaggi 4.19.1-4.19.3. Dopo aver rimosso l’ultimo (quarto) tampone di lavaggio, rimuovere la piastra per microtitolazione dal separatore magnetico a piastre e risospendere le microsfere in PBS-TBN/pozzetto da 100 μL con un pipettatore. Analizza i risultati.Leggere la piastra sul sistema di analisi del flusso a doppio reporter per determinare l’MFI di ciascuna reazione utilizzando le seguenti impostazioni dello strumento: volume di aspirazione = 50 μL; numero minimo di perline = 100 perline; impostazione timeout = 40 s; gating: 7.000-17.000; modalità di funzionamento = Dual Reporter. Con il sistema a doppio reporter, assicurarsi che il Canale Reporter 1 misuri la fluorescenza PE arancione (quantità di rhPD-L1 attaccata alle perle coniugate rhPD-1) e che il Canale Reporter 2 misuri la fluorescenza blu BV421 (quantità di anticorpo bloccante attaccato legato a rhPD-L1). Eseguire pozzetti duplicati per ogni condizione e calcolare la media dei due valori MFI di output per ogni condizione prima di eseguire ulteriori calcoli e grafici dei dati. Standardizzare il valore MFI di ciascun campione rispetto al controllo negativo e calcolare la percentuale di inibizione per ciascun campione:Inibizione% = (100 × [MFI di controllo negativo − MFI campione])/MFI di controllo negativoNOTA: I valori MFI del controllo negativo (nessuna inibizione) sono i valori più alti; l’MFI del segnale PD-L1 legato è del 100% e l’inibizione del legame di rhPD-L1 a rhPD-1 è definita come 0%. Figura 1: Schema del saggio di blocco PD-1/PD-L1 a doppio reporter. Il PD-L1 umano ricombinante biotinilato (rhPD-L1) viene pre-incubato con anticorpi anti-PDL1 indotti da PDL1-Vaxx selezionati prima di combinarsi con microsfere magnetiche accoppiate a rhPD-1 per consentire la formazione del complesso del checkpoint PD-1/PD-L1. La rhPD-L1 complessata viene quindi rilevata e marcata con l’aggiunta di ficoeritrina accoppiata a streptavidina (SAPE, fluoroforo arancione). Gli anticorpi contro gli epitopi PDL1-Vaxx hanno come bersaglio rhPD-L1 che si è complessato con rhPD-1 pre-accoppiato alle biglie magnetiche e sono illuminati utilizzando un anticorpo secondario coniugato Brilliant Violet 421 (BV421, fluoroforo blu). Sia gli anticorpi rhPD-L1 biotinilati che sono complessati con PD-1 (segnale PE) che gli anticorpi anti-PDL1 che riconoscono e legano rhPD-L1 (segnale BV421) vengono analizzati contemporaneamente utilizzando uno strumento citometrico a flusso a doppio reporter che interroga i campioni per entrambi i fluorofori in due canali reporter separati. I valori di output per ciascun campione sono l’intensità mediana della fluorescenza di ciascun fluoroforo. L’inibizione della formazione del complesso PD1/PD-L1 da parte di diversi anticorpi indotti da PDL1-Vaxx viene quindi estrapolata confrontando i segnali sperimentali con quelli generati utilizzando un anticorpo monoclonale di controllo negativo che non lega rhPD-L1 (0% di inibizione). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.