Анализ магнитного флуоресцентного потока на основе магнитных флуоресцентных шариков блокады взаимодействия PD-1/PD-L1 пептидным пептидом PDL1-Vaxx

1. Подготовка эксперимента ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация обо всех реагентах/оборудовании, упомянутых на этом этапе, приведена в таблице материалов. Получить рекомбинантный человеческий PD-1 (rhPD-1; полигистидин-меченый). Перед использованием восстановите лиофилизированный rhPD1 стерильно-фильтрованным фосфатно-солевым буфером (PBS), pH 7,4. Получить биотинилированный рекомбинантный человеческий PD-L1 (rhPD-L1). Перед использованием восстановите лиофилизированный rhPD-L1 стерильной деионизированной водой. Получить реагент для детекции R-фикоэритрина, конъюгированный стрептавидин-конъюгированным (SAPE). Храните все растворы SAPE в защищенном от света месте при температуре холодильника (т.е. 2-8 °C). Получите флуоресцентно окрашенные магнитные микросферы (диаметр 6,5 мкм, полистирол с вложенным магнетитом) и набор для соединения шариков15 (если используется, см. таблицу материалов). Ковалентное связывание с микросферами требует сульфо-NHS (сульфо-N-гидросукцинимида) и EDC (N-[3-диметиламинопропил]-N′-этилкарбодиимида гидрохлорида).ПРИМЕЧАНИЕ: Наборы магнитных шариков поставляются с любой из 500 уникальных флуоресцентных меток, что позволяет идентифицировать и дифференцировать их от различных наборов шариков16. Гранулы предлагаются в концентрациях 2,5 × 106 шариков/мл и 12,5 × 106 шариков/мл. Храните шарики в защищенном от света месте при температуре холодильника (т.е. 2-8 °C). Не замораживайте суспензии бортиков. Получение положительных и отрицательных контрольных антител и антител вторичного обнаружения, меченных Brilliant Violet 421 (BV421). Храните все флуоресцентно-сопряженные молекулы в защищенном от света месте. Выполняйте все реакции связывания в пробирках с низким содержанием белка и все реакции анализа в 96-луночных микротитровальных планшетах с низким содержанием белка с круглым дном. Запечатайте планшеты одноразовой клейкой пленкой или пластиковыми крышками для 96-луночных микропланшетов для этапов инкубации анализа. Используйте магнитный пластинчатый сепаратор для иммобилизации шариков на этапах промывки.ПРИМЕЧАНИЕ: Система анализа потока с двумя репортерами имеет три лазера: (1) один, который идентифицирует и количественно определяет флуоресценцию, специфичную для набора шариков (канал классификации); (2) тот, который обнаруживает и количественно определяет флуоресценцию специфичного для мишени фикоэритрина (ПЭ) (Reporter Channel 1; возбуждение 532 нм, «оранжевое» излучение 565-585 нм); и (3) тот, который обнаруживает и количественно определяет специфичную для мишени флуоресценцию BV421 второго целевого аналита (Reporter Channel 2; возбуждение 405 нм, «синий» излучение 421-441 нм). 2. Соединение rhPD-1 с магнитными шариками ПРИМЕЧАНИЕ: Соединяемый белок не должен содержать бычьего сывороточного альбумина (BSA), азида натрия, глицина, глицерина, трис(гидрокси-метил)аминометана (Tris) или аминосодержащих добавок и должен быть суспендирован в PBS при pH 7,4. Доступен коммерческий комплект муфт, который включает в себя все необходимые реагенты и буферы, описанные в настоящем документе (см. таблицу материалов). Выньте все связующие реагенты из холодильника и дайте им уравновеситься до комнатной температуры (RT, 18-22 °C) в течение 20-30 минут. Ресуспендируйте исходные микросферы путем кратковременного вихряния, ультразвуковой обработки или вращения (15 минут при 15-30 об/мин), согласно информационному листу продукта. Переложите 1 × 106 магнитных шариков в пробирку микроцентрифуги с низким содержанием белка объемом 1,5 мл (см. таблицу материалов). Промывка шариков с 100 мкл активационного буфера15: 0,1 М2PO4 (одноосновный), pH 6,2.ПРИМЕЧАНИЕ: Сопряжение также может быть выполнено с использованием предварительно сконфигурированного комплекта для сопряжения, который включает 0,1 М 2-морфолиноэтансульфоновая кислота (MES), pH 6,0, в качестве альтернативного буфера активации и связывания (см. Таблицу материалов).Поместите пробирку с шариками в магнитный сепаратор на 1-2 минуты.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы гранулы можно разделить микроцентрифугированием при ≥8 000 × г в течение 1-2 минут. Отсасывайте надосадочную жидкость пипеткой из иммобилизованных магнитом или гранулированных шариков, при этом пробирка все еще находится в магнитном сепараторе. Извлеките пробирку микроцентрифуги из магнита и добавьте 80 мкл буфера связи (см. Таблицу материалов). Осторожно встряхните реакционную трубку и обрабатывайте ультразвуком в течение 20 с, чтобы диспергировать шарики. Активируйте шарики с помощью sulfo-NHS и EDC.ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный раствор sulfo-NHS составляет 50 мг/мл, растворенный в активационном буфере. Исходный раствор EDC также составляет 50 мг/мл, растворенный в активационном буфере. Как активационный буфер, так и влага в атмосфере вызывают деградацию EDC. Не рекомендуется использовать хранящееся решение EDC. Приготовьте достаточное количество свежего EDC-раствора перед этапом и используйте его сразу же, когда раствор будет готов. Выбросьте излишки EDC-раствора.ВНИМАНИЕ: EDC вызывает сильное раздражение глаз и раздражает дыхательные пути и кожу.Добавьте 10 мкл sulfo-NHS в пробирку с микрофугой, содержащую промытые и активированные гранулы. Добавьте 10 мкл исходного раствора EDC в пробирку с микрофугой, содержащую гранулы и сульфо-NHS. Защитите светочувствительные микросферы от света и вращайте на вращателе в течение 20 минут при 15-30 об/мин, при RT (18-22 °C). В качестве альтернативы трубка может оставаться неподвижной на этапе активации, если ее осторожно вихрять для перераспределения шариков с интервалом в 10 минут. Смойте излишки реагентов сцепления с бортов.Поместите пробирку с активированными шариками в магнитный сепаратор на 1-2 минуты. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью пипетки из магнитных или гранулированных шариков, при этом пробирка все еще находится в магнитном сепараторе. Извлеките пробирку микроцентрифуги из магнита и добавьте 100 мкл активационного буфера. Осторожно встряхните реакционную трубку, чтобы рассеять шарики. Повторите шаги 2.6.1-2.6.4 еще два раза, чтобы в общей сложности выполнить три стирки. В конце промывки гранулы будут суспендированы в 100 мкл активационного буфера в приблизительной концентрации 10 × 106 шариков/мл. Соедините пептид rhPD-1 с активированными шариками.Добавьте 390 мкл активационного буфера в пробирку, содержащую активированные шарики, чтобы довести общий объем суспензии шарика до 490 мкл. Добавьте 1 мкг пептида PD-1 к активированной суспензии гранул, добавив 10 мкл раствора пептида PD-1 (1 мг/мл, растворенный в PBS) в пробирку, содержащую активированные шарики. Кратковременно встряхните пробирку микроцентрифуги, чтобы равномерно распределить PD-1 и активированные шарики. Инкубируют шарики с ПД-1 в течение 2 ч в темноте при РТ (18-22 °С) при вращении (15-30 об/мин). Промойте бусины дважды (2 раза) с использованием пробирного буфера (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).Поместите пробирку с активированными шариками в магнитный сепаратор на 1-2 минуты. Отсасывайте надосадочную жидкость пипеткой из иммобилизованных магнитом или гранулированных шариков, при этом пробирка все еще находится в магнитном сепараторе. Извлеките пробирку микроцентрифуги из магнита и добавьте 100 мкл активационного буфера. Осторожно встряхните реакционную трубку, чтобы рассеять шарики. Повторите шаги 2.8.1-2.8.4 еще один раз, чтобы выполнить в общей сложности две стирки. В конце промывки гранулы будут суспендированы в 100 мкл активационного буфера в концентрации 10 ×10 6 шариков/мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для анализа/промывки может быть изготовлен без азида натрия (консерванта), если буфер также не используется в качестве среды хранения. Храните шарики, связанные rhPD-1, в темноте в холодильнике при температуре 2-8 °C, если они не используются немедленно. Гранулы, связанные с белками, стабильны до 18 месяцев. 3. Оценка успешного соединения rhPD-1 с шариками ПРИМЕЧАНИЕ: Микросферы, связанные с rhPD-1, вступают в реакцию с биотинилированным rhPD-L1, последний из которых обнаруживается путем инкубации с SAPE с последующей оценкой на проточном цитометре. Это подтверждает как успешное связывание PD-1 с магнитными шариками, так и функциональное взаимодействие между белками rhPD-1 и rhPD-L1. Создать серию серийных разведений биотинилированного рПД-L1 в PBS-TBN (исходный раствор рПД-L1 составляет 1 мг/мл). Окончательный диапазон концентраций rhPD-L1, который необходимо протестировать, составляет от 8 мкг/мл до 313 пг/мл. Создайте объемы 150 мкл каждого разведения rhPD-L1: 50 мкл на каждую реакцию и две реакции на условие, а также достаточный избыток для компенсации потерь при пипетировании.Маркируйте пробирки для разведения rhPD-L1 как 8 мкг/мл, 4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл, 0,125 мкг/мл, 0,063 мкг/мл и 0,031 мкг/мл. Пробирка 0 мкг/мл (только PBS-TBN) служит контролем no-PD-L1. Предварительно загрузите 150 мкл PBS-TBN во все маркированные пробирки для разведения rhPD-L1.ПРИМЕЧАНИЕ: Самая высокая конечная концентрация rhPD-L1 для тестирования составляет 8 мкг/мл, а rhPD-L1 будет разбавлен 1:1 при добавлении в реакционную смесь, поэтому пробирка для разведения с маркировкой «8 мкг/мл» относится к конечной концентрации и фактически содержит 16 мкг/мл rhPD-L1. Этикетки на всех пробирках для разведения указывают конечную концентрацию rhPD-L1 после добавления в реакцию. Создайте разбавление rhPD-L1 с самой высокой концентрацией (16 мкг/мл). Это двухступенчатое 62,5-кратное разведение исходного раствора rhPD-L1 в дозе 1 мг/мл (1000 мкг/16 мкг = 62,5).Смешайте 84 мкл PBS-TBN с 16 мкл исходного раствора rhPD-L1 (1 мг/мл, т. е. 1 000 мкл) в пробирке для микроцентрифуги. Это 6,25-кратное разведение, а результирующая концентрация составляет 160 мкг/мл rhPD-L1. В пробирке с маркировкой «8 мкг/мл» смешайте 270 мкл PBS-TBN с 30 мкл разведения rhPD-L1, полученного на предыдущем этапе (160 мкг/мл). Это 10-кратное разведение, а результирующая концентрация фактически составляет 16 мкг/мл. Маркировка пробирки «8 мкг/мл» указывает на его конечную концентрацию после добавления в реакцию. Перелейте 150 мкл разведения rhPD-L1, созданного на этапе 3.1.3 («8 мкг/мл»), в пробирку «4 мкг/мл», закройте крышку пробирки микроцентрифуги и кратковременно перемешайте раствор. Повторяйте шаг 3.1.4 последовательно до тех пор, пока не будет завершена серия разведения rhPD-L1. После создания все пробирки от «8 мкг/мл» до «0,063 мкг/мл», а также контрольная пробирка 0 мкг/мл должны содержать 150 мкл раствора, а последняя пробирка, «0,031 мкг/мл», должна содержать 300 мкл раствора. Таким образом, создается достаточный объем каждого разведения для тестирования 50 мкл каждого биотинилированного разведения rhPD-L1 в повторяющихся реакциях, при этом остается достаточный избыток для компенсации потерь при пипетировании. Подсчитайте количество шариков, связанных с rhPD-1, с помощью гемоцитометра17. Разбавьте исходные гранулы, связанные с rhPD-1, до 5 × 104 шариков/мл, с объемом, достаточным для 2 500 шариков/50 мкл/реакция. Вмешайте 5 × 104 шариков/мл суспензии rhPD-1 и пипетку 50 мкл суспензии в каждую меченую/картированную лунку 96-луночного микротитрового планшета с круглым дном так, чтобы для каждого тестируемого разведения rhPD-L1 были созданы дублирующиеся лунки. Добавьте 50 мкл каждой биотинилированной пробирки для разведения rhPD-L1, созданной на этапе 3.1, в соответствующие лунки на планшете микротитра. Накройте планшет с микротитрами одноразовой фольгой или пластиковым клейким герметиком для пластин и инкубируйте планшет в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере (600 об/мин). Смойте излишки биотинилированного rhPD-L1 с шариков.Перенесите запечатанную пластину из орбитального шейкера в магнитный сепаратор пластин на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики. Осторожно снимите герметик для клейкой пластины, убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните пластину и вылейте надосадочную жидкость в раковину или контейнер для биологически опасных жидких отходов, если это необходимо. Аккуратно, но быстро постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить оставшуюся надосадочную жидкость. Извлеките микротитровую пластину из сепаратора магнитных пластин и пипеткой 150 мкл PBS-TBN в каждую лунку. Поместите незапечатанную пластину на магнитный сепаратор на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики. Убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните планшет и вылейте надосадочную жидкость в раковину или контейнер для биологически опасных жидких отходов, если это необходимо. Аккуратно, но быстро постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить оставшуюся надосадочную жидкость. Повторите шаги промывки пластин 3.7.3-3.7.5 два раза, в общей сложности три промывки по 150 мкл PBS-TBN каждая. Убедитесь, что в конце последнего этапа промывки в лунках не осталось надосадочной жидкости. Работайте неуклонно, чтобы не допустить высыхания обездвиженных шариков на дне колодца. Добавьте реагент SAPE Detection.Разбавьте исходный раствор SAPE в PBS-TBN до рабочей концентрации 6 мкг/мл. Подготовьте достаточный объем рабочего раствора SAPE, чтобы все реакционные лунки могли принимать 100 мкл/лунку с достаточным запасом для компенсации потерь при пипетировании. Извлеките микротитровую пластину из магнитного пластинчатого сепаратора. Добавьте 100 мкл рабочего раствора SAPE в каждую реакционную лунку и повторно суспендируйте промытые шарики с помощью пипетирования. Запечатайте 96-луночный планшет с микротитром с помощью фольги или пластикового клейкого герметика для пластин и инкубируйте в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере при 600 об/мин. Извлеките микротитровую пластину из инкубатора, перенесите ее в магнитный сепаратор пластин для иммобилизации шариков, снимите герметик для клейких пластин и трижды промойте шарики 150 мкл PBS-TBN, как описано в шагах 3.7.3-3.7.5. После удаления окончательной промывки извлеките пластину из магнитного пластинчатого сепаратора и повторно суспендируйте шарики в 100 мкл PBS-TBN на лунку. Проанализируйте результаты.Прочтите табличку на приборе для анализа потока (см. Таблицу материалов), чтобы определить медианную интенсивность флуоресценции (MFI) каждой реакции, используя следующие настройки прибора: объем аспирации = 50 мкл; минимальное количество бусин = 100 бусин; настройка таймаута = 40 с; литник = 7 000-17 000; режим работы = Один репортер. Повторяющиеся скважины выполняются для каждого условия, и два выходных значения MFI для каждого условия усредняются перед выполнением дальнейших вычислений данных и построения графиков.ПРИМЕЧАНИЕ: Значение MFI для каждого разведения должно показывать концентрационно-зависимое связывание, указывая на приемлемую эффективность связывания rhPD-1 с шариками и подтверждая хорошее взаимодействие рекомбинантных белков PD-1/PD-L1. 4. Блокирующий анализ PD-L1 на основе магнитных шариков PD-1/PD-L1 ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ оценивает блокирующую активность растворимых медиаторов (например, анти-PDL1-пептидных антител) на рекомбинантные взаимодействия PD1/PD-L1. Вкратце, биотинилированный rhPD-L1 предварительно инкубируют с антителами, вырабатываемыми у кроликов после различных инокуляций пептидов PDL1-Vaxx. Затем смесь антител rhPD-L1 + анти-PDL1 захватывают с помощью магнитных шариков, связанных с rhPD-1, а связывание rhPD-L1 с шариками, связанными с rhPD-1, количественно определяют путем добавления стрептавидина-ПЭ. Сигнал флуоресценции ПЭ обратно коррелирует с блокирующей активностью исследуемых антител/ингибиторов PDL1. Связывание антител к пептиду к PDL1 оценивается одновременно путем связывания вторичного антитела к кролику (для антител к пептиду PDL1) или к человеку (для контрольных антител) и путем оценки флуоресценции BV421 во втором канале прибора. Этапы анализа наглядно представлены на рисунке 1. Подготовьте серию тестовых антител с двукратным серийным разведением, включая поликлональные антитела-кандидаты, индуцированные PDL1-Vaxx, антитела с отрицательным контролем (трастузумаб, герцептин, гуманизированное моноклональное антитело против HER2) и положительное контрольное антитело (атезолизумаб; гуманизированное моноклональное антитело против PDL1 IgG1). Для каждой реакции будет использоваться 25 мкл назначенного разведения антител, поэтому показанные объемы достаточны для выполнения каждой реакции в двух лунках для каждого условия (т. е. 50 мкл на условие), с некоторым избытком, остающимся для компенсации потерь при пипетировании.Для каждого индуцированного вакциной антитела к PDL1-пептиду и контрольного антитела убедитесь, что диапазон конечных концентраций антител составляет от 1000 мкг/мл до 8 мкг/мл. Приготовьте исходные растворы всех антител в концентрации 2000 мкг/мл. Для каждого антитела пометьте пробирки для разведения как 1 000 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 63 мкг/мл, 31 мкг/мл, 16 мкг/мл и 8 мкг/мл и укажите название антитела. Для каждого антитела также добавьте пробирку «0 мкг/мл», которая будет использоваться только в транспортном средстве (PBS-TBN).ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении в реакционную смесь концентрация антител будет разбавлена 1:1. Пробирки для разведения антител помечены как конечная концентрация антител после добавления в реакцию и фактически содержат в два раза больше антител, чем на этикетке. Добавьте 75 мкл PBS-TBN во все пробирки для разведения антител с маркировкой «500 мкг/мл» и ниже, включая контрольные пробирки «0 мкг/мл», предназначенные только для транспортных средств. Для каждого антитела пипетку 150 мкл из 2 000 мкг/мл исходного раствора в соответствующую пробирку с маркировкой «1 000 мкг/мл». Это будет использоваться для всех последующих разведений для каждого антитела. Для каждого антитела создайте полную серию разведений, перенося пипеткой 75 мкл из пробирки «1000 мкг/мл» в пробирку со следующим меньшим разведением в серии (т.е. «500 мкг/мл»). Закройте только что готовую пробирку для разведения, кратковременно встряхните ее и продолжайте построение серии разведения, перенося 75 мкл из пробирки «500 мкг/мл» в пробирку «250 мкг/мл». Повторяйте эту схему до тех пор, пока не будет произведено последнее разведение «8 мкг/мл» для всех антител.ПРИМЕЧАНИЕ: В завершенной серии разведения для каждого антитела должен быть объем 75 мкл для всех пробирок, кроме самого низкого разведения, 8 мкг/мл, который должен содержать объем 150 мкл. Для каждой реакции будет использоваться 25 мкл разведения антител, поэтому этих объемов достаточно для выполнения каждой реакции в дублирующих лунках для каждого условия (т. е. 50 мкл на каждое состояние), с дополнительным для компенсации потерь при пипетировании. Поместите 25 мкл разбавленных антител в специально отведенные лунки 96-луночного микротитрового планшета. Разбавляют биотинилированный rhPD-L1 до рабочей концентрации 4 мкг/мл в PBS-TBN в объеме, достаточном для включения 25 мкл в дублирующиеся лунки на условие (т. е. 50 мкл на состояние) с дополнительным количеством для компенсации потерь при пипетировании.ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе биотинилированный rhPD-L1 в концентрации 4 мкг/мл привел к получению примерно 50% максимального сигнала MFI, измеренного при более ранней оценке сопряжения, и был использован для анализа блокады PD-1/PD-L1. Добавьте 25 мкл биотинилированного rhPD-L1 (4 мкг/мл) в каждую реакционную лунку, накройте микротитровую пластину фольгой или пластиковой клейкой пломбой и инкубируйте при RT (18-22 °C) в течение 1 ч при встряхивании на орбитальной пластинчатой шейкере при 600 об/мин. Разбавьте гранулы, связанные rhPD-1, до 50 000 шариков/мл с достаточным объемом для 50 мкл/лунка (2 500 шариков на лунку) плюс дополнительно для компенсации потерь при пипетировании. Извлеките 96-луночную реакционную пластину микротитра из шейкера и снимите клейкое уплотнение. Добавьте 50 мкл смеси гранул rhPD-1 в каждую лунку. Запечатайте планшет и инкубируйте в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере при 600 об/мин. Перенесите запечатанную пластину из орбитального шейкера в магнитный сепаратор пластин на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики. Осторожно снимите герметик для клейкой пластины, убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните пластину и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить излишки надосадочной жидкости. Смойте излишки реагентов с шариков.Извлеките микротитровую пластину из магнитного пластинчатого сепаратора и добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую лунку. Поместите микротитровую пластину на магнитный пластинчатый сепаратор на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики. Убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните планшет и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить излишки надосадочной жидкости. Повторите шаги промывки пластин 4.11.1-4.11.3 два раза, в общей сложности три промывки PBS-TBN. Убедитесь, что реагент SAPE приготовлен (см. ниже) перед удалением окончательного (третьего) промывочного раствора. Добавьте реагент для обнаружения SAPE.Разбавляют исходный раствор SAPE до рабочей концентрации 6 мкг/мл в PBS-TBN; сделать достаточный объем для 100 мкл/лунку, плюс дополнительно для компенсации потерь при пипетировании. Добавьте 100 мкл/лунку рабочего раствора SAPE в каждую реакционную лунку и ресуспендируйте гранулы путем пипетирования. Запечатайте планшет и инкубируйте в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере при 600 об/мин. Сцедите излишки SAPE из реакции.Перенесите запечатанную пластину из орбитального шейкера в магнитный сепаратор пластин на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики. Осторожно снимите герметик клейкой пластины, убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните пластину и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить надосадочную жидкость, содержащую излишки SAPE. Смойте излишки SAPE с бусин.Извлеките микротитровую пластину из держателя магнитной пластины. Добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую лунку, чтобы повторно суспендировать шарики. Поместите микротитровую пластину на магнитный пластинчатый сепаратор на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики. Убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно прилегают друг к другу, переверните планшет и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить излишки надосадочной жидкости. Выполните два дополнительных этапа промывки с PBS-TBN, чтобы в общей сложности получить три стирки, повторив шаги 4.15.1–4.15.4. Перед удалением последнего (третьего) промывочного раствора подготовьте конгугированные BV421 вторичные антитела к обнаружению (следующий этап). Добавьте вторичные антитела, конгугированные BV421.Разбавьте BV421-конгугированный античеловеческий IgG (для обнаружения гуманизированных контрольных антител) и BV421-конгугированный антикроличий IgG (для обнаружения поликлональных антител, индуцированных PDL1-Vaxx) (см. таблицу материалов) в соотношении 1:400 в буфере для промывки/анализа в объемах, достаточных для использования 100 мкл/лунка каждого из них, с дополнительными для компенсации потерь при пипетировании. Добавьте 100 мкл разбавленного BV421-конъюгированного античеловеческого IgG или BV421-конъюгированного антикроличьего IgG в соответствующие лунки. Запечатайте планшет и инкубируйте в течение 1 ч в темноте при RT (18-22 °C) на орбитальном шейкере при 600 об/мин. Сцеживание избыточных вторичных антител, конъюгированных с BV421, из шариков.Перенесите запечатанную пластину из орбитального шейкера в магнитный сепаратор пластин на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики. Осторожно снимите герметик клейкой пластины, убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно соединены друг с другом, переверните пластину и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить надосадочную жидкость, содержащую избыток вторичных антител, конъюгированных с BV421. Смойте излишки конъюгированных BV421 вторичных антител из шариков.Добавьте 150 мкл PBS-TBN в каждую лунку, чтобы повторно суспендировать шарики. Поместите микротитровую пластину на магнитный пластинчатый сепаратор на 2 минуты, чтобы обездвижить шарики. Убедитесь, что магнит и микротитровая пластина надежно прилегают друг к другу, переверните планшет и сбросьте надосадочную жидкость. Осторожно постучите перевернутой пластиной по подушке из впитывающей бумажной ткани, чтобы удалить излишки надосадочной жидкости. Выполните три дополнительных этапа стирки с PBS-TBN, чтобы в общей сложности выполнить четыре стирки, повторив шаги 4.19.1–4.19.3. После удаления последнего (четвертого) промывочного буфера извлеките микротитровую пластину из магнитного планшетного сепаратора и повторно суспендируйте шарики в 100 мкл PBS-TBN/лунку с помощью пипеттора. Проанализируйте результаты.Считайте показания таблички на двухрепортерной системе анализа потока, чтобы определить MFI каждой реакции, используя следующие настройки прибора: объем аспирации = 50 мкл; минимальное количество бусин = 100 бусин; настройка таймаута = 40 с; стробирование: 7,000-17,000; режим работы = Dual Reporter. При использовании системы с двумя репортерами убедитесь, что Reporter Channel 1 измеряет флуоресценцию оранжевого PE (количество rhPD-L1, прикрепленных к конъюгированным шарикам rhPD-1), а Reporter Channel 2 измеряет флуоресценцию синего BV421 (количество прикрепленных блокирующих антител, связанных с rhPD-L1). Запустите дублирующиеся скважины для каждого условия и усредните два выходных значения MFI для каждого условия, прежде чем выполнять дальнейшие вычисления данных и построение графиков. Стандартизируйте значение MFI для каждого образца до отрицательного контроля и рассчитайте процент ингибирования для каждого образца:Ингибирование % = (100 × [МФО отрицательного контроля − МФО выборки])/МФО с отрицательным контролемПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные контрольные значения MFI (без ингибирования) являются самыми высокими значениями; связанный сигнал PD-L1 MFI равен 100%, а ингибирование связывания rhPD-L1 с rhPD-1 определено как 0%. Рисунок 1: Схема двухрепортерного блокадного анализа PD-1/PD-L1. Биотинилированный рекомбинантный человеческий PD-L1 (rhPD-L1) предварительно инкубируют с выбранными антителами PDL1-Vaxx, индуцированными анти-PDL1, а затем соединяют с магнитными шариками, связанными с rhPD-1, чтобы обеспечить образование комплекса контрольных точек PD-1/PD-L1. Затем обнаруживается и маркируется комплексированный rhPD-L1 с добавлением стрептавидин-связанного фикоэритрина (SAPE, оранжевый флуорофор). Антитела против эпитопов PDL1-Vaxx нацелены на rhPD-L1, который интегрировался в rhPD-1, предварительно связанный с магнитными шариками, и они подсвечиваются с помощью вторичного антитела, конъюгированного Brilliant Violet 421 (BV421, синий флуорофор). Как биотинилированные rhPD-L1, которые комплексируются с PD-1 (сигнал PE), так и антитела против PDL1, которые распознают и связывают rhPD-L1 (сигнал BV421), анализируются одновременно с помощью двухрепортерного проточного цитометрического прибора, который опрашивает образцы на наличие обоих флуорофоров в двух отдельных репортерных каналах. Выходные значения для каждого образца представляют собой медианную интенсивность флуоресценции каждого флуорофора. Ингибирование образования комплекса PD1/PD-L1 различными антителами, индуцированными PDL1-Vaxx, затем экстраполируют путем сравнения экспериментальных сигналов с сигналами, полученными с помощью моноклонального антитела с отрицательным контролем, которое не связывается с rhPD-L1 (ингибирование 0%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.