Analyse de flux à double rapporteur à base de billes fluorescentes magnétiques du blocage de l’interaction-1/-L1 par les anticorps induits par le vaccin PDL1-VAXX

1. Préparation expérimentale REMARQUE : Les détails de tous les réactifs/équipements mentionnés à cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Obtenir de la-1 humaine recombinante (rhPD-1 ; marquée à la polyhistidine). Reconstituer le rhPD1 lyophilisé avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) filtrée stérile, pH 7,4, avant utilisation. Obtenir de la-L1 humaine recombinante biotinylée (rhPD-L1). Reconstituer le rhPD-L1 lyophilisé avec de l’eau stérile déminéralisée avant utilisation. Procurez-vous le réactif de détection de la R-phycoérythrine conjugué à la streptavidine (SAPE). Conservez toutes les solutions SAPE à l’abri de la lumière à la température du réfrigérateur (c’est-à-dire entre 2 et 8 °C). Procurez-vous des microsphères magnétiques teintées par fluorescence (6,5 μm de diamètre, polystyrène avec magnétite intégrée) et le kit de couplage de billes15 (le cas échéant, voir le tableau des matériaux). Le couplage covalent aux microsphères nécessite du sulfo-NHS (sulfo-N-hydrosuccinimide) et de l’EDC (chlorhydrate de N-[3-diméthylaminopropyl]-N′-éthylcarbodiimide).REMARQUE : Les ensembles de billes magnétiques sont disponibles avec l’une des 500 étiquettes fluorescentes uniques, ce qui permet l’identification et la différenciation des différents ensembles de billes16. Les billes sont offertes à des concentrations de stock de 2,5 × 106 perles/mL et de 12,5 × 106 perles/mL. Conservez les billes à l’abri de la lumière à la température du réfrigérateur (c’est-à-dire entre 2 et 8 °C). Ne pas congeler les suspensions de billes. Obtenez des anticorps témoins positifs et négatifs et des anticorps de détection secondaire marqués au violet brillant 421 (BV421). Conservez toutes les molécules conjuguées fluorescentes à l’abri de la lumière. Effectuez toutes les réactions de couplage dans des tubes de liaison à faible teneur en protéines et toutes les réactions de dosage dans des plaques de microtitration à faible teneur en protéines, à fond rond et à 96 puits. Scellez les plaques avec une feuille adhésive jetable ou des couvercles de microplaques en plastique à 96 puits pour les étapes d’incubation du test. Utilisez un séparateur à plaques magnétiques pour immobiliser les billes pendant les étapes de lavage du dosage.REMARQUE : Le système d’analyse de flux à double rapporteur comporte trois lasers : (1) un qui identifie et quantifie la fluorescence spécifique à l’ensemble des billes (canal de classification) ; (2) celui qui détecte et quantifie la fluorescence de la phycoérythrine (PE) spécifique à la cible (Reporter Channel 1 ; excitation à 532 nm, émission « orange » à 565-585 nm) ; et (3) celui qui détecte et quantifie la fluorescence BV421 spécifique à la cible d’un deuxième analyte cible (Reporter Channel 2 ; excitation de 405 nm, émission « bleue » de 421-441 nm). 2. Couplage rhPD-1 aux billes magnétiques REMARQUE : La protéine à coupler doit être exempte d’albumine sérique bovine (BSA), d’azoture de sodium, de glycine, de glycérol, de tris(hydroxy-méthyl)aminométhane (Tris) ou d’additifs contenant des amines et doit être en suspension dans du PBS à un pH de 7,4. Il existe un kit de couplage commercial qui comprend tous les réactifs et tampons nécessaires décrits dans le présent document (voir le tableau des matériaux). Retirez tous les réactifs de couplage du réfrigérateur et laissez-les s’équilibrer à température ambiante (RT, 18-22 °C) pendant 20 à 30 min. Remettre les microsphères d’origine en suspension en les mettant brièvement en vortex, en les sonisant ou en les faisant tourner (15 min à 15-30 tr/min), selon la fiche d’information du produit. Transférer 1 × 106 billes magnétiques dans un tube de microcentrifugation à faible teneur en protéines de 1,5 ml (voir le tableau des matériaux). Billes de lavage avec 100 μL de tampon d’activation15 : 0,1 M NaH2PO4 (monobasique), pH 6,2.REMARQUE : Le couplage peut également être effectué à l’aide d’un kit de couplage préconfiguré, qui comprend 0,1 M d’acide 2-morpholinoéthanesulfonique (MES), pH 6,0, comme tampon d’activation et de couplage alternatif (voir le tableau des matériaux).Placez le tube contenant les billes dans un séparateur magnétique pendant 1 à 2 min.REMARQUE : Alternativement, les billes peuvent être séparées par microcentrifugation à ≥8 000 × g pendant 1 à 2 minutes. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette à partir des billes immobilisées par aimant ou en granulés avec le tube toujours positionné dans le séparateur magnétique. Retirez le tube de la microcentrifugeuse de l’aimant et ajoutez 80 μL de tampon de couplage (voir le tableau des matériaux). Faire tourner doucement le tube de réaction et soniser pendant 20 s pour disperser les billes. Activez les billes avec du sulfo-NHS et de l’EDC.REMARQUE : La solution mère de sulfo-NHS est de 50 mg/mL dissous dans le tampon d’activation. La solution mère d’EDC est également dissoute à 50 mg/mL dans le tampon d’activation. Le tampon d’activation et l’humidité dans l’atmosphère provoquent la dégradation de l’EDC. Il n’est pas conseillé d’utiliser une solution EDC stockée. Préparez juste assez de solution EDC fraîche avant l’étape et utilisez-la immédiatement lorsque la solution est prête. Jetez l’excédent de solution EDC.MISE EN GARDE : L’EDC provoque une grave irritation des yeux et est un irritant des voies respiratoires et de la peau.Ajouter 10 μL de sulfo-NHS dans le tube microfuge contenant les billes lavées et activées. Ajouter 10 μL de solution mère d’EDC dans le tube de microfuge contenant les billes et le sulfo-NHS. Protégez les microsphères photosensibles de la lumière et faites tourner le rotateur pendant 20 min à 15-30 tr/min, à RT (18-22 °C). Alternativement, le tube peut rester immobile pendant l’étape d’activation s’il est doucement vortex pour redistribuer les billes à des intervalles de 10 minutes. Lavez l’excès de réactifs de couplage des billes.Placez le tube contenant les billes activées dans un séparateur magnétique pendant 1 à 2 min. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette à partir de billes immobilisées ou granulées avec le tube toujours positionné dans le séparateur magnétique. Retirez le tube de la microcentrifugeuse de l’aimant et ajoutez 100 μL de tampon d’activation. Faites vortex le tube de réaction doucement pour disperser les billes. Répétez les étapes 2.6.1 à 2.6.4 deux fois de plus pour un total de trois lavages. À la fin du lavage, les billes seront suspendues dans 100 μL de tampon d’activation à une concentration approximative de 10 × 106 billes/mL. Couplez le peptide rhPD-1 aux billes activées.Ajoutez 390 μL de tampon d’activation dans le tube contenant les billes activées pour porter le volume total de la suspension des billes à 490 μL. Ajouter 1 μg de peptide-1 à la suspension de billes activées en ajoutant 10 μL de solution peptidique-1 (1 mg/mL dissous dans du PBS) dans le tube contenant les billes activées. Faites un bref vortex dans le tube de la microcentrifugeuse pour répartir uniformément le-1 et les billes activées. Incuber les billes avec-1 pendant 2 h dans l’obscurité à RT (18-22 °C) avec rotation (15-30 tr/min). Lavez les billes deux fois (2x) à l’aide d’un tampon d’essai/lavage (PBS-TBN : 1x PBS, pH 7,4 + 0,1 % BSA + 0,05 % Tween-20 + 0,05 % NaN315).Placez le tube contenant les billes activées dans un séparateur magnétique pendant 1 à 2 min. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette à partir des billes immobilisées par aimant ou en granulés avec le tube toujours positionné dans le séparateur magnétique. Retirez le tube de la microcentrifugeuse de l’aimant et ajoutez 100 μL de tampon d’activation. Faites vortex le tube de réaction doucement pour disperser les billes. Répétez les étapes 2.8.1 à 2.8.4 une fois de plus pour un total de deux lavages. À la fin du lavage, les billes seront mises en suspension dans 100 μL de tampon d’activation à une concentration de 10 × 106 billes/mL.REMARQUE : Le tampon d’analyse/lavage peut être fabriqué sans azoture de sodium (conservateur) si le tampon n’est pas également utilisé comme milieu de stockage. Conservez les billes couplées à rhPD-1 dans l’obscurité au réfrigérateur à une température de 2 à 8 °C si elles ne sont pas utilisées immédiatement. Les billes couplées aux protéines sont stables jusqu’à 18 mois. 3. Évaluation du couplage réussi de rhPD-1 aux billes NOTE : Les microsphères couplées à rhPD-1 réagissent avec la rhPD-L1 biotinylée, cette dernière étant détectée par incubation avec SAPE suivie d’une évaluation sur le cytomètre en flux. Cela permet de vérifier à la fois le couplage réussi de-1 aux billes magnétiques et l’interaction fonctionnelle entre les protéines rhPD-1 et rhPD-L1. Créer une série de dilution en deux fois de rhPD-L1 biotinylée dans le PBS-TBN (la solution mère de rhPD-L1 est de 1 mg/mL). La plage de concentration finale de rhPD-L1 à tester est d’une solution de 8 μg/mL à une solution de 313 pg/mL. Créer des volumes de 150 μL de chaque dilution rhPD-L1 : 50 μL pour chaque réaction et deux réactions par condition, plus un excès suffisant pour tenir compte des pertes de pipetage.Étiqueter les tubes de microfuge de dilution rhPD-L1 comme suit : 8 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,25 μg/mL, 0,125 μg/mL, 0,063 μg/mL et 0,031 μg/mL. Un tube de 0 μg/mL (PBS-TBN uniquement) sert de témoin sans-L1. Précharger 150 μL de PBS-TBN dans tous les tubes de dilution rhPD-L1 marqués.REMARQUE : La concentration finale la plus élevée de rhPD-L1 à tester est de 8 μg/mL, et la rhPD-L1 sera diluée 1 :1 lors de l’ajout au mélange réactionnel, de sorte que le tube de dilution étiqueté « 8 μg/mL » fait référence à la concentration finale et contient en fait 16 μg/mL de rhPD-L1. Les étiquettes sur tous les tubes de dilution indiquent la concentration finale de rhPD-L1 après addition à la réaction. Créer la dilution rhPD-L1 la plus élevée (16 μg/mL réel). Il s’agit d’une dilution en deux étapes de 62,5 fois de la solution mère de rhPD-L1 à 1 mg/mL (1 000 μg/16 μg = 62,5).Combiner 84 μL de PBS-TBN avec 16 μL de solution mère de rhPD-L1 (1 mg/mL, c’est-à-dire 1 000 μL) dans un tube de microcentrifugation. Il s’agit d’une dilution de 6,25 fois et la concentration résultante est de 160 μg/mL rhPD-L1. Dans le tube étiqueté « 8 μg/mL », mélanger 270 μL de PBS-TBN avec 30 μL de la dilution rhPD-L1 créée à l’étape précédente (160 μg/mL). Il s’agit d’une dilution 10 fois plus élevée, et la concentration résultante est en fait de 16 μg/mL. L’étiquette du tube « 8 μg/mL » fait référence à sa concentration finale après addition à la réaction. Transférez 150 μL de la dilution rhPD-L1 créée à l’étape 3.1.3 (« 8 μg/mL ») dans le tube « 4 μg/mL », fermez le bouchon du tube de la microcentrifugeuse et tourbillonnez brièvement pour mélanger la solution. Répétez l’étape 3.1.4 séquentiellement jusqu’à ce que la série de dilution rhPD-L1 soit terminée. Après création, tous les tubes entre « 8 μg/mL » et « 0,063 μg/mL », ainsi que le témoin de 0 μg/mL, doivent contenir 150 μL de solution, et le dernier tube, « 0,031 μg/mL », doit contenir 300 μL de solution. Cela crée un volume suffisant de chaque dilution pour tester 50 μL de chaque dilution de rhPD-L1 biotinylée dans des réactions dupliquées, avec un excédent suffisant pour compenser les pertes de pipetage. Comptez les billes couplées à rhPD-1 à l’aide d’un hémocytomètre17. Diluer les billes de base couplées à rhPD-1 à 5 × 104 billes/mL, avec un volume suffisant pour 2 500 billes/50 μL/réaction. Faire vortex la suspension de billes couplées à rhPD-1 de 5 × 104 billes/mL et pipeter 50 μL de la suspension dans chaque puits marqué/cartographié d’une plaque de microtitration à fond rond de 96 puits afin qu’il y ait des puits dupliqués créés pour chaque dilution rhPD-L1 testée. Ajouter 50 μL de chaque tube de dilution rhPD-L1 biotinylé créé à l’étape 3.1 dans les puits appropriés sur la plaque de microtitration. Couvrir la plaque de microtitration d’une feuille jetable ou d’une scelleuse de plaque adhésive en plastique, et incuber la plaque pendant 1 h dans l’obscurité à RT (18-22 °C) sur un agitateur orbital (600 tr/min). Laver l’excès de rhPD-L1 biotinylé des billes.Transférez la plaque scellée de l’agitateur orbital vers le séparateur à plaque magnétique pendant 2 min pour immobiliser les billes. Retirez avec précaution le scellant de la plaque adhésive, vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien ensemble, puis retournez la plaque et jetez les surnageants dans un évier ou un conteneur à déchets liquides à risque biologique, selon le cas. Tapotez doucement mais vivement la plaque inversée sur un coussin de papier absorbant pour retirer le surnageant restant. Retirez la plaque de microtitration du séparateur à plaques magnétiques et pipetez 150 μL de PBS-TBN dans chaque puits. Placez la plaque non scellée sur le séparateur magnétique pendant 2 min pour immobiliser les billes. S’assurer que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien ensemble, puis retournez la plaque et déversez les surnageants dans un évier ou un récipient à déchets liquides à risque biologique, selon le cas. Tapotez doucement mais vivement la plaque inversée sur un coussin de papier absorbant pour retirer le surnageant restant. Répétez les étapes de lavage des plaques 3.7.3 à 3.7.5 deux fois pour un total de trois lavages avec 150 μL de PBS-TBN chacun. Assurez-vous qu’il ne reste aucun surnageant dans les puits à la fin de la dernière étape de lavage. Travaillez régulièrement pour éviter que les billes immobilisées ne sèchent au fond du puits. Ajoutez le réactif de détection SAPE.Diluer la solution mère SAPE dans du PBS-TBN à une concentration utile de 6 μg/mL. Préparer un volume suffisant de solution de travail SAPE pour que tous les puits de réaction puissent recevoir 100 μL/puits, avec suffisamment de surplus pour supporter les pertes de pipetage. Retirez la plaque de microtitration du séparateur à plaques magnétiques. Ajouter 100 μL de solution de travail SAPE dans chaque puits de réaction et remettre en suspension les billes lavées par pipetage. Sceller la plaque de microtitration à 96 puits à l’aide d’une feuille d’aluminium ou d’une plaque adhésive en plastique et incuber pendant 1 h dans l’obscurité à RT (18-22 °C) sur un agitateur orbital à 600 tr/min. Retirez la plaque de microtitration de l’incubateur, transférez-la dans le séparateur à plaques magnétiques pour immobiliser les billes, retirez le scellant adhésif de la plaque et lavez les billes trois fois avec 150 μL PBS-TBN, comme décrit aux étapes 3.7.3 à 3.7.5. Après avoir retiré le lavage final, retirez la plaque du séparateur à plaques magnétiques et remettez les billes en suspension dans 100 μL de PBS-TBN par puits. Analysez les résultats.Lisez la plaque de l’instrument d’analyse de l’écoulement (voir le tableau des matériaux) pour déterminer l’intensité de fluorescence médiane (MFI) de chaque réaction à l’aide des paramètres suivants de l’instrument : volume d’aspiration = 50 μL ; nombre minimum de perles = 100 perles ; réglage du délai d’attente = 40 s ; déclenchement = 7 000 à 17 000 ; mode de fonctionnement = Rapporteur unique. Des puits dupliqués sont exécutés pour chaque condition, et les deux valeurs MFI de sortie pour chaque condition sont moyennées avant d’effectuer d’autres calculs de données et de représenter graphiquement.NOTA : La valeur MFI de chaque dilution doit montrer une liaison dépendante de la concentration, ce qui indique une efficacité de couplage acceptable de rhPD-1 aux billes et confirme une bonne interaction des protéines recombinantes PD-1/PD-L1. 4. Test de blocage-1 /-L1 à billes magnétiques-L1 NOTE : Ce test évalue l’activité bloquante des médiateurs solubles (par exemple, les anticorps anti-PDL1-peptide) sur les interactions PD1/-L1 recombinantes. En bref, le rhPD-L1 biotinylé est préincubé avec des anticorps générés chez le lapin après différentes inoculations de peptides PDL1-Vaxx. Le mélange d’anticorps rhPD-L1 + anti-PDL1 est ensuite capturé à l’aide de billes magnétiques couplées à rhPD-1, et la liaison de rhPD-L1 aux billes couplées à rhPD-1 est quantifiée par l’ajout de streptavidine-PE. Le signal de fluorescence PE est inversement corrélé à l’activité bloquante des anticorps/inhibiteurs anti-PDL1 testés. La liaison à l’anticorps anti-PDL1-peptide est évaluée simultanément par la liaison d’un anticorps secondaire anti-lapin couplé à BV421 (pour les anticorps anti-PDL1-peptide) ou anti-humain (pour les anticorps témoins) et par l’évaluation de la fluorescence BV421 dans le deuxième canal de l’instrument. Les étapes de l’essai sont illustrées à la figure 1. Préparer une série de dilution en deux parties des anticorps testés, y compris des candidats anticorps polyclonaux induits par PDL1-Vaxx, un anticorps témoin négatif (trastuzumab, Herceptin, anticorps monoclonal anti-HER2 humanisé) et un anticorps témoin positif (atezolizumab ; anticorps monoclonal IgG1 anti-PDL1 humanisé). Chaque réaction utilisera 25 μL de la dilution d’anticorps assignée, de sorte que les volumes indiqués sont suffisants pour effectuer chaque réaction dans des puits en double par condition (c.-à-d. 50 μL par condition), avec un certain excédent restant pour tenir compte des pertes de pipetage.Pour chaque anticorps anti-PDL1-peptide induit par le vaccin et chaque anticorps témoin, assurez-vous que la plage des concentrations finales d’anticorps testées est comprise entre 1 000 μg/mL et 8 μg/mL. Préparer des solutions mères de tous les anticorps à 2 000 μg/mL. Pour chaque anticorps, étiquetez les tubes de dilution comme suit : 1 000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 63 μg/mL, 31 μg/mL, 16 μg/mL et 8 μg/mL, et indiquez le nom de l’anticorps. Pour chaque anticorps, ajoutez également un tube « 0 μg/mL », qui sera le témoin du véhicule seul (PBS-TBN).REMARQUE : Lorsqu’il est ajouté au mélange réactionnel, la concentration d’anticorps sera diluée 1 :1. Les tubes de dilution d’anticorps sont marqués comme la concentration finale d’anticorps après addition à la réaction et contiennent en fait deux fois plus d’anticorps que ce qui est marqué. Ajouter 75 μL de PBS-TBN à tous les tubes de dilution d’anticorps étiquetés « 500 μg/mL » et moins, y compris les tubes témoins « 0 μg/mL » pour véhicules seulement. Pour chaque anticorps, pipeter 150 μL de la solution mère à 2 000 μg/mL dans le tube correspondant étiqueté « 1 000 μg/mL ». Cela sera utilisé pour effectuer toutes les dilutions ultérieures pour chaque anticorps. Pour chaque anticorps, créez une série de dilution complète en transférant à la pipette 75 μL du tube « 1 000 μg/mL » vers le tube avec la dilution la plus basse suivante dans la série (c.-à-d. « 500 μg/mL »). Fermez le tube de dilution nouvellement terminé, faites-le tourbillonner brièvement et poursuivez la construction de la série de dilution en transférant 75 μL du tube « 500 μg/mL » au tube « 250 μg/mL ». Répétez ce schéma jusqu’à ce que la dernière dilution, « 8 μg/mL », ait été effectuée pour tous les anticorps.REMARQUE : Dans la série de dilution terminée pour chaque anticorps, il doit y avoir un volume de 75 μL pour tous les tubes, à l’exception de la dilution la plus faible, 8 μg/mL, qui doit contenir un volume de 150 μL. Chaque réaction utilisera 25 μL de dilution d’anticorps, de sorte que ces volumes sont suffisants pour effectuer chaque réaction dans des puits dupliqués par condition (c.-à-d. 50 μL par condition), avec un supplément pour tenir compte des pertes de pipetage. Placer 25 μL d’anticorps dilués dans les puits désignés d’une plaque de microtitration à 96 puits. Diluer le rhPD-L1 biotinylé à une concentration utile de 4 μg/mL dans du PBS-TBN à un volume suffisant pour inclure 25 μL dans des puits en double par condition (c.-à-d. 50 μL par condition), avec un supplément pour tenir compte des pertes de pipetage.NOTE : Dans ce travail, la rhPD-L1 biotinylée à 4 μg/mL a donné lieu à environ 50 % du signal MFI maximal mesuré dans l’évaluation antérieure du couplage et a été utilisée pour l’analyse du blocage-1/-L1. Ajouter 25 μL de rhPD-L1 biotinylé (4 μg/mL) dans chaque puits de réaction, recouvrir la plaque de microtitration d’une feuille ou d’un joint adhésif en plastique et incuber à RT (18-22 °C) pendant 1 h en agitant sur un agitateur à plaque orbitale à 600 tr/min. Diluer les billes couplées à rhPD-1 à 50 000 billes/mL, avec un volume suffisant pour 50 μL/puits (2 500 billes/puits) plus un supplément pour tenir compte des pertes de pipetage. Retirez la plaque de réaction de microtitration à 96 puits de l’agitateur et retirez le joint de la plaque adhésive. Ajouter 50 μL du mélange de billes couplées à rhPD-1 dans chaque puits. Sceller la plaque et incuber pendant 1 h dans l’obscurité à RT (18-22 °C) sur un agitateur orbital à 600 tr/min. Transférez la plaque scellée de l’agitateur orbital vers le séparateur à plaque magnétique pendant 2 min pour immobiliser les billes. Retirez soigneusement le scellant de la plaque adhésive, vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien ensemble, puis retournez la plaque et videz les surnageants. Tapotez doucement la plaque inversée sur un coussin de papier absorbant pour éliminer l’excès de surnageant. Lavez l’excès de réactifs de réaction des billes.Retirez la plaque de microtitration du séparateur à plaques magnétiques et ajoutez 150 μL de PBS-TBN dans chaque puits. Placez la plaque de microtitration sur le séparateur à plaques magnétiques pendant 2 min pour immobiliser les billes. Vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien ensemble, puis retournez la plaque et videz les surnageants. Tapotez doucement la plaque inversée sur un coussin de papier absorbant pour éliminer l’excès de surnageant. Répétez les étapes de lavage des plaques 4.11.1 à 4.11.3 deux fois, pour un total de trois lavages avec PBS-TBN. Assurez-vous que le réactif SAPE est préparé (ci-dessous) avant de retirer la dernière (troisième) solution de lavage. Ajoutez le réactif de détection SAPE.Diluer la solution mère SAPE à une concentration de travail de 6 μg/mL dans du PBS-TBN ; faire un volume suffisant pour 100 μL/puits, plus un supplément pour tenir compte des pertes de pipetage. Ajouter 100 μL/puits de solution de travail SAPE dans chaque puits de réaction et remettre les billes en suspension par pipetage. Sceller la plaque et incuber pendant 1 h dans l’obscurité à RT (18-22 °C) sur un agitateur orbital à 600 tr/min. Décanter l’excès de SAPE de la réaction.Transférez la plaque scellée de l’agitateur orbital vers le séparateur à plaque magnétique pendant 2 min pour immobiliser les billes. Retirez avec précaution le scellant de la plaque adhésive, vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien ensemble, puis retournez la plaque et videz le surnageant. Tapotez doucement la plaque inversée sur un coussin de papier absorbant pour retirer le surnageant contenant l’excès de SAPE. Laver l’excédent de SAPE sur les perles.Retirez la plaque de microtitration du support de plaque magnétique. Ajouter 150 μL de PBS-TBN dans chaque puits pour remettre les billes en suspension. Placez la plaque de microtitration sur le séparateur à plaques magnétiques pendant 2 min pour immobiliser les billes. Vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien ensemble, puis retournez la plaque et videz le surnageant. Tapotez doucement la plaque inversée sur un coussin de papier absorbant pour éliminer l’excès de surnageant. Effectuez deux étapes de lavage supplémentaires avec PBS-TBN pour un total de trois lavages en répétant les étapes 4.15.1 à 4.15.4. Préparez les anticorps de détection secondaire BV421 (étape suivante) avant de retirer la solution de lavage finale (troisième). Ajoutez les anticorps secondaires configurés par BV421.Diluer les IgG anti-humaines congugées BV421 (pour détecter les anticorps témoins humanisés) et les IgG anti-lapin congugées par BV421 (pour détecter les anticorps polyclonaux induits par PDL1-Vaxx) (voir le tableau des matériaux) 1 :400 dans un tampon de lavage/dosage à des volumes suffisants pour utiliser 100 μL/puits de chaque, avec un supplément pour compenser les pertes de pipetage. Ajouter 100 μL d’IgG anti-humain conjugué BV421 dilué ou d’IgG anti-lapin conjugué BV421 dans les puits appropriés. Sceller la plaque et incuber pendant 1 h dans l’obscurité à RT (18-22 °C) sur un agitateur orbital à 600 tr/min. Décanter l’excès d’anticorps secondaires conjugués BV421 des billes.Transférez la plaque scellée de l’agitateur orbital vers le séparateur à plaque magnétique pendant 2 min pour immobiliser les billes. Retirez avec précaution le scellant de la plaque adhésive, vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien ensemble, puis retournez la plaque et videz le surnageant. Tapotez doucement la plaque inversée sur un coussin de papier absorbant pour retirer le surnageant contenant l’excès d’anticorps secondaires conjugués BV421. Lavez l’excès d’anticorps secondaires conjugués BV421 des billes.Ajouter 150 μL de PBS-TBN dans chaque puits pour remettre les billes en suspension. Placez la plaque de microtitration sur le séparateur à plaques magnétiques pendant 2 min pour immobiliser les billes. Vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien ensemble, puis retournez la plaque et videz le surnageant. Tapotez doucement la plaque inversée sur un coussin de papier absorbant pour éliminer l’excès de surnageant. Effectuez trois étapes de lavage supplémentaires avec PBS-TBN pour un total de quatre lavages en répétant les étapes 4.19.1 à 4.19.3. Après avoir retiré le dernier (quatrième) tampon de lavage, retirez la plaque de microtitration du séparateur à plaques magnétiques et remettez les billes en suspension dans un puits de 100 μL PBS-TBN/à l’aide d’une pipette. Analysez les résultats.Lire la plaque sur le système d’analyse de débit à double rapporteur pour déterminer l’IMF de chaque réaction à l’aide des paramètres suivants de l’instrument : volume d’aspiration = 50 μL ; nombre minimum de perles = 100 perles ; réglage du délai d’attente = 40 s ; contrôle : 7 000 à 17 000 ; mode de fonctionnement = Dual Reporter. Avec le système à double rapporteur, assurez-vous que le Reporter Channel 1 mesure la fluorescence orange PE (quantité de rhPD-L1 attachée aux billes conjuguées rhPD-1) et que le Reporter Channel 2 mesure la fluorescence bleue BV421 (quantité d’anticorps bloquant attaché lié à rhPD-L1). Exécutez des puits en double pour chaque condition et faites la moyenne des deux valeurs MFI en sortie pour chaque condition avant d’effectuer d’autres calculs de données et d’effectuer des graphiques. Standardisez la valeur MFI de chaque échantillon au témoin négatif et calculez le pourcentage d’inhibition pour chaque échantillon :% d’inhibition = (100 × [IMF témoin négatif − IMF échantillon])/IMF témoin négatifREMARQUE : Les valeurs négatives de l’IMF de contrôle (pas d’inhibition) sont les valeurs les plus élevées ; l’IMF du signal-L1 lié est de 100 % et l’inhibition de la liaison de rhPD-L1 à rhPD-1 est définie comme étant de 0 %. Figure 1 : Schéma de l’essai de blocage-1/-L1 à double rapporteur. Le-L1 humain recombinant biotinylé (rhPD-L1) est pré-incubé avec des anticorps anti-PDL1 induits par PDL1-Vaxx avant de se combiner avec des billes magnétiques couplées à rhPD-1 pour permettre la formation de complexes de points de contrôle-1/-L1. La rhPD-L1 complexée est ensuite détectée et marquée par l’ajout de phycoérythrine couplée à la streptavidine (SAPE, fluorophore orange). Les anticorps dirigés contre les épitopes de PDL1-Vaxx ciblent rhPD-L1 qui s’est complexé en rhPD-1 pré-couplé aux billes magnétiques, et ils sont éclairés à l’aide d’un anticorps secondaire conjugué au violet brillant 421 (BV421, fluorophore bleu). Les anticorps rhPD-L1 biotinylés qui sont complexés à-1 (signal PE) et les anticorps anti-PDL1 qui reconnaissent et se lient au rhPD-L1 (signal BV421) sont analysés simultanément à l’aide d’un instrument de cytométrie en flux à double rapporteur qui interroge les échantillons pour les deux fluorophores dans deux canaux rapporteurs distincts. Les valeurs de sortie pour chaque échantillon sont l’intensité de fluorescence médiane de chaque fluorophore. L’inhibition de la formation du complexe PD1/-L1 par différents anticorps induits par PDL1-Vaxx est ensuite extrapolée en comparant les signaux expérimentaux à ceux générés à l’aide d’un anticorps monoclonal témoin négatif qui ne se lie pas à rhPD-L1 (inhibition de 0%). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.