Análisis de flujo de doble reportero basado en perlas fluorescentes magnéticas del bloqueo de anticuerpos inducidos por la vacuna del péptido PDL1-Vaxx de la interacción PD-1/PD-L1

1. Preparación experimental NOTA: Los detalles de todos los reactivos/equipos mencionados en este paso se enumeran en la Tabla de Materiales. Obtener PD-1 humana recombinante (rhPD-1; marcada con polihistidina). Reconstituya rhPD1 liofilizado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) filtrada estérilmente, pH 7,4, antes de su uso. Obtener PD-L1 humana recombinante biotinilada (rhPD-L1). Reconstituya rhPD-L1 liofilizado con agua desionizada estéril antes de su uso. Obtener el reactivo de detección de R-ficoeritrina conjugada con estreptavidina (SAPE). Guarde todas las soluciones SAPE protegidas de la luz a temperaturas frigoríficas (es decir, 2-8 °C). Obtenga microesferas magnéticas teñidas con fluorescencia (6,5 μm de diámetro, poliestireno con magnetita incrustada) y el kit de acoplamiento de cordones15 (si se utiliza, consulte la tabla de materiales). El acoplamiento covalente a las microesferas requiere sulfo-NHS (sulfo-N-hidrosuccinimida) y EDC (clorhidrato de N-[3-dimetilaminopropil]-N′-etilcarbodiimida).NOTA: Los juegos de cuentas magnéticas están disponibles con cualquiera de las 500 etiquetas fluorescentes únicas, lo que permite la identificación y diferenciación de diferentes juegos de cuentas16. Las perlas se ofrecen en concentraciones de 2,5 × 106 perlas/ml y 12,5 × 106 perlas/ml. Guarde las perlas protegidas de la luz a temperaturas frigoríficas (es decir, 2-8 °C). No congele las suspensiones de cuentas. Obtenga anticuerpos de control positivos y negativos y anticuerpos de detección secundaria marcados con Brilliant Violet 421 (BV421). Almacene todas las moléculas conjugadas fluorescentes protegidas de la luz. Realice todas las reacciones de acoplamiento en tubos de unión a proteínas bajas y todas las reacciones de ensayo en placas de microtitulación de 96 pocillos, de fondo redondo y de unión a proteínas bajas. Selle las placas con una lámina adhesiva desechable o cubiertas de microplacas de plástico de 96 pocillos para los pasos de incubación del ensayo. Utilice un separador de placas magnéticas para inmovilizar las perlas durante los pasos de lavado del ensayo.NOTA: El sistema de análisis de flujo de doble reportero tiene tres láseres: (1) uno que identifica y cuantifica la fluorescencia específica del conjunto de perlas (canal de clasificación); (2) uno que detecte y cuantifique la fluorescencia de ficoeritrina (PE) específica del objetivo (Canal Reportero 1; excitación de 532 nm, emisión “naranja” de 565-585 nm); y (3) uno que detecta y cuantifica la fluorescencia BV421 específica de un segundo analito objetivo (Reporter Channel 2; excitación de 405 nm, emisión “azul” de 421-441 nm). 2. Acoplamiento rhPD-1 a perlas magnéticas NOTA: La proteína a acoplar debe estar libre de albúmina sérica bovina (BSA), azida sódica, glicina, glicerol, tris(hidroxi-metil)aminometano (Tris) o aditivos que contengan aminas y debe suspenderse en PBS a pH 7.4. Existe un kit de acoplamiento comercial que incluye todos los reactivos y tampones necesarios que se describen en este documento (consulte la Tabla de materiales). Retire todos los reactivos de acoplamiento del refrigerador y déjelos equilibrar a temperatura ambiente (RT, 18-22 °C) durante 20-30 min. Vuelva a suspender las microesferas originales mediante vórtice, sonicación o rotación (15 minutos a 15-30 rpm), de acuerdo con la hoja de información del producto. Transfiera 1 × 106 perlas magnéticas a un tubo de microcentrífuga de unión a proteínas de 1,5 ml (consulte la Tabla de materiales). Lavar las perlas con 100 μL de tampón de activación15: 0,1 M NaH2PO4 (monobásico), pH 6,2.NOTA: El acoplamiento también se puede realizar utilizando un kit de acoplamiento preconfigurado, que incluye ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) 0,1 M, pH 6,0, como tampón alternativo de activación y acoplamiento (consulte la Tabla de materiales).Coloque el tubo que contiene las perlas en un separador magnético durante 1-2 minutos.NOTA: Alternativamente, las perlas se pueden separar por microcentrifugación a ≥8.000 × g durante 1-2 min. Aspire el sobrenadante con una pipeta de las perlas inmovilizadas o granuladas con el tubo aún colocado en el separador magnético. Retire el tubo de microcentrífuga del imán y agregue 80 μL de tampón de acoplamiento (consulte la Tabla de materiales). Agite suavemente el tubo de reacción y sonique durante 20 s para dispersar las perlas. Activar las perlas con sulfo-NHS y EDC.NOTA: La solución madre de sulfo-NHS es de 50 mg/ml disueltos en tampón de activación. La solución madre de EDC también es 50 mg/ml disuelta en tampón de activación. Tanto el tampón de activación como la humedad de la atmósfera provocan la degradación de los EDC. No es aconsejable utilizar una solución EDC almacenada. Prepare la suficiente solución EDC fresca antes del paso y úsela inmediatamente cuando la solución esté lista. Deseche el exceso de solución EDC.PRECAUCIÓN: El EDC causa irritación ocular severa y es un irritante de las vías respiratorias y de la piel.Añadir 10 μL de sulfo-NHS al tubo de microfuga que contiene las perlas lavadas y activadas. Añadir 10 μL de solución madre de EDC al tubo de microfuga que contiene las perlas y el sulfo-NHS. Proteja las microesferas fotosensibles de la luz y gire sobre el rotador durante 20 minutos a 15-30 rpm, a RT (18-22 °C). Alternativamente, el tubo puede permanecer estacionario durante el paso de activación si se agita suavemente en vórtice para redistribuir las perlas a intervalos de 10 minutos. Lave el exceso de reactivos de acoplamiento de las perlas.Coloque el tubo que contiene las perlas activadas en un separador magnético durante 1-2 minutos. Aspire el sobrenadante con una pipeta de perlas inmovilizadas por imanes o granuladas con el tubo aún colocado en el separador magnético. Retire el tubo de microcentrífuga del imán y agregue 100 μL de tampón de activación. Agite suavemente el tubo de reacción para dispersar las perlas. Repita los pasos 2.6.1-2.6.4 dos veces más para un total de tres lavados. Al final del lavado, las perlas se suspenderán en 100 μL de tampón de activación a una concentración aproximada de 10 × 106 perlas/mL. Acople el péptido rhPD-1 a las perlas activadas.Agregue 390 μL de tampón de activación al tubo que contiene las perlas activadas para aumentar el volumen total de suspensión de perlas hasta 490 μL. Añadir 1 μg de péptido PD-1 a la suspensión de perlas activadas añadiendo 10 μL de solución peptídica PD-1 (1 mg/ml disuelto en PBS) al tubo que contiene las perlas activadas. Agite brevemente el tubo de la microcentrífuga para distribuir uniformemente el PD-1 y las perlas activadas. Incubar las perlas con PD-1 durante 2 h en la oscuridad a RT (18-22 °C) con rotación (15-30 rpm). Lave las perlas dos veces (2x) con tampón de ensayo/lavado (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).Coloque el tubo que contiene las perlas activadas en un separador magnético durante 1-2 minutos. Aspire el sobrenadante con una pipeta de las perlas inmovilizadas o granuladas con el tubo aún colocado en el separador magnético. Retire el tubo de microcentrífuga del imán y agregue 100 μL de tampón de activación. Agite suavemente el tubo de reacción para dispersar las perlas. Repita los pasos 2.8.1 a 2.8.4 una vez más para un total de dos lavados. Al final del lavado, las perlas se suspenderán en 100 μL de tampón de activación a una concentración de 10 × 106 perlas/ml.NOTA: El tampón de ensayo/lavado se puede hacer sin azida de sodio (conservante) si el tampón no se usa también como medio de almacenamiento. Guarde las perlas acopladas a rhPD-1 en la oscuridad en el refrigerador a 2-8 °C si no se usa inmediatamente. Las perlas acopladas a proteínas son estables hasta por 18 meses. 3. Evaluación del acoplamiento exitoso de rhPD-1 a los cordones NOTA: Las microesferas acopladas a rhPD-1 reaccionan con rhPD-L1 biotinilada, la última de las cuales se detecta mediante incubación con SAPE seguida de una evaluación en el citómetro de flujo. Esto verifica tanto el acoplamiento exitoso de PD-1 a las perlas magnéticas como la interacción funcional entre las proteínas rhPD-1 y rhPD-L1. Cree una serie de diluciones en serie dobles de rhPD-L1 biotinilado en PBS-TBN (la solución original de rhPD-L1 es de 1 mg/ml). El rango final de concentración de rhPD-L1 que se va a probar es una solución de 8 μg/mL hasta una solución de 313 pg/mL. Cree volúmenes de 150 μl de cada dilución rhPD-L1: 50 μl para cada reacción y dos reacciones por condición, más un exceso suficiente para acomodar las pérdidas de pipeteo.Etiquete los tubos de microfuga de dilución rhPD-L1 como 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml, 0,125 μg/ml, 0,063 μg/ml y 0,031 μg/ml. Un tubo de 0 μg/ml (solo PBS-TBN) sirve como control no-PD-L1. Precargue 150 μL de PBS-TBN en todos los tubos de dilución rhPD-L1 marcados.NOTA: La concentración final más alta de rhPD-L1 que se debe probar es de 8 μg/mL, y el rhPD-L1 se diluirá 1:1 al agregarlo a la mezcla de reacción, por lo que el tubo de dilución etiquetado como “8 μg/mL” se refiere a la concentración final y en realidad contiene 16 μg/mL rhPD-L1. Las etiquetas de todos los tubos de dilución indican la concentración final de rhPD-L1 después de la adición a la reacción. Cree la dilución de rhPD-L1 de mayor concentración (16 μg/ml real). Se trata de una dilución de 62,5 veces en dos pasos de la solución madre rhPD-L1 de 1 mg/ml (1.000 μg/16 μg = 62,5).Combine 84 μL de PBS-TBN con 16 μL de solución madre rhPD-L1 (1 mg/mL, es decir, 1.000 μL) en un tubo de microcentrífuga. Se trata de una dilución de 6,25 veces y la concentración resultante es de 160 μg/ml de rhPD-L1. En el tubo marcado como “8 μg/mL”, combine 270 μL de PBS-TBN con 30 μL de la dilución rhPD-L1 creada en el paso anterior (160 μg/mL). Se trata de una dilución de 10 veces, y la concentración resultante es en realidad de 16 μg/mL. La etiqueta del tubo “8 μg/mL” se refiere a su concentración final después de la adición a la reacción. Transfiera 150 μL de la dilución rhPD-L1 creada en el paso 3.1.3 (“8 μg/mL”) al tubo “4 μg/mL”, cierre la tapa del tubo de microcentrífuga y haga un vórtice breve para mezclar la solución. Repita el paso 3.1.4 secuencialmente hasta completar la serie de dilución rhPD-L1. Después de la creación, todos los tubos entre “8 μg/mL” y “0,063 μg/mL”, así como el control de 0 μg/mL, deben contener 150 μL de solución, y el último tubo, “0,031 μg/mL”, debe contener 300 μL de solución. Esto crea un volumen suficiente de cada dilución para probar 50 μL de cada dilución biotinilada de rhPD-L1 en reacciones duplicadas, con suficiente exceso restante para acomodar las pérdidas de pipeteo. Cuente las cuentas acopladas a rhPD-1 con un hemocitómetro17. Diluir las perlas acopladas con rhPD-1 a 5 × 104 perlas/ml, con un volumen suficiente para 2.500 perlas/50 μl/reacción. Agite la suspensión de perlas acopladas a 5 × 104 perlas/ml rhPD-1 y pipetee 50 μL de la suspensión en cada pocillo marcado/mapeado de una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos para que se creen pocillos duplicados para cada dilución rhPD-L1 que se esté probando. Añadir 50 μL de cada tubo de dilución biotinilado rhPD-L1 creado en el paso 3.1 a los pocillos apropiados de la placa de microtitulación. Cubra la placa de microtitulación con una lámina desechable o un sellador de placas adhesivas de plástico e incube la placa durante 1 h en la oscuridad a RT (18-22 °C) en un agitador orbital (600 rpm). Lave el exceso de rhPD-L1 biotinilado de las perlas.Transfiera la placa sellada del agitador orbital al separador de placas magnéticas durante 2 minutos para inmovilizar las perlas. Retire con cuidado el sellador de placas adhesivas, confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien unidos, invierta la placa y vierta los sobrenadantes en un fregadero o contenedor de desechos líquidos de riesgo biológico, según corresponda. Golpee suave pero enérgicamente la placa invertida sobre un cojín de papel absorbente para eliminar el sobrenadante restante. Retire la placa de microtitulación del separador de placas magnéticas y pipetee 150 μL de PBS-TBN en cada pocillo. Coloque la placa sin sellar en el separador magnético durante 2 minutos para inmovilizar las cuentas. Confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien unidos, e invierta la placa y vierta los sobrenadantes en un fregadero o contenedor de desechos líquidos de riesgo biológico, según corresponda. Golpee suave pero enérgicamente la placa invertida sobre un cojín de papel absorbente para eliminar el sobrenadante restante. Repita los pasos de lavado de placas 3.7.3-3.7.5 dos veces para un total de tres lavados con 150 μL de PBS-TBN cada uno. Asegúrese de que no quede sobrenadante en los pocillos al final del último paso de lavado. Trabaje constantemente para evitar que se sequen las perlas inmovilizadas en el fondo de los pozos. Agregue el reactivo de detección SAPE.Diluir la solución madre de SAPE en PBS-TBN hasta una concentración de trabajo de 6 μg/mL. Prepare un volumen suficiente de solución de trabajo SAPE para que todos los pocillos de reacción puedan recibir 100 μL/pocillo, con suficiente extra para acomodar las pérdidas de pipeteo. Retire la placa de microtitulación del separador de placas magnéticas. Agregue 100 μL de solución de trabajo SAPE en cada pocillo de reacción y vuelva a suspender las perlas lavadas mediante pipeteo. Selle la placa de microtitulación de 96 pocillos con un sellador de placas adhesivas de aluminio o plástico e incube durante 1 h en la oscuridad a RT (18-22 °C) en un agitador orbital a 600 rpm. Retire la placa de microtitulación de la incubadora, transfiérala al separador de placas magnéticas para inmovilizar las perlas, retire el sellador de placas adhesivas y lave las perlas tres veces con 150 μL PBS-TBN, como se describe en los pasos 3.7.3-3.7.5. Después de retirar el lavado final, retire la placa del separador de placas magnéticas y vuelva a suspender las perlas en 100 μL de PBS-TBN por pocillo. Analiza los resultados.Lea la placa en el instrumento de análisis de flujo (consulte la Tabla de materiales) para determinar la intensidad de fluorescencia media (MFI) de cada reacción utilizando los siguientes ajustes del instrumento: volumen de aspiración = 50 μL; número mínimo de cuentas = 100 cuentas; ajuste de tiempo de espera = 40 s; compuerta = 7.000-17.000; modo de funcionamiento = Reportero único. Se ejecutan pozos duplicados para cada condición y se promedian los dos valores de MFI de salida para cada condición antes de realizar más cálculos y gráficos de datos.NOTA: El valor MFI de cada dilución debe mostrar una unión dependiente de la concentración, lo que indica una eficiencia aceptable de acoplamiento de rhPD-1 a las perlas y confirma una buena interacción de las proteínas recombinantes PD-1/PD-L1. 4. Ensayo de bloqueo PD-1/PD-L1 basado en perlas magnéticas PD-L1 NOTA: Este ensayo evalúa la actividad de bloqueo de mediadores solubles (p. ej., anticuerpos anti-péptido PDL1) en las interacciones recombinantes PD1/PD-L1. Brevemente, el rhPD-L1 biotinilado se preincuba con anticuerpos generados en conejos después de diferentes inoculaciones con el péptido PDL1-Vaxx. A continuación, se captura la mezcla de anticuerpos rhPD-L1 + anti-PDL1 utilizando perlas magnéticas acopladas a rhPD-1, y la unión de rhPD-L1 a las perlas acopladas a rhPD-1 se cuantifica mediante la adición de estreptavidina-PE. La señal de fluorescencia de PE se correlaciona inversamente con la actividad de bloqueo de los anticuerpos/inhibidores anti-PDL1 probados. La unión de anticuerpos anti-péptido PDL1 se evalúa simultáneamente mediante la unión de un anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a BV421 (para anticuerpos anti-péptido PDL1) o anti-humano (para anticuerpos de control) y mediante la evaluación de la fluorescencia BV421 en el segundo canal del instrumento. Los pasos del ensayo se detallan gráficamente en la Figura 1. Preparar una serie de diluciones en serie de dos veces de los anticuerpos de prueba, incluidos los candidatos a anticuerpos policlonales inducidos por PDL1-Vaxx, un anticuerpo de control negativo (trastuzumab, Herceptin, anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado) y un anticuerpo de control positivo (atezolizumab; anticuerpo monoclonal humanizado anti-PDL1 IgG1). Cada reacción utilizará 25 μL de la dilución de anticuerpos asignada, por lo que los volúmenes mostrados son suficientes para realizar cada reacción en pocillos duplicados por condición (es decir, 50 μL por condición), quedando algo de exceso para acomodar las pérdidas de pipeteo.Para cada anticuerpo anti-péptido PDL1 inducido por la vacuna y anticuerpo de control, asegúrese de que el rango de las concentraciones finales de anticuerpos analizadas sea de 1.000 μg/ml a 8 μg/ml. Preparar soluciones madre de todos los anticuerpos a 2.000 μg/mL. Para cada anticuerpo, etiquete los tubos de dilución como 1.000 μg/ml, 500 μg/ml, 250 μg/ml, 125 μg/ml, 63 μg/ml, 31 μg/ml, 16 μg/ml y 8 μg/ml, e incluya el nombre del anticuerpo. Para cada anticuerpo, agregue también un tubo de “0 μg/mL”, que será el control solo del vehículo (PBS-TBN).NOTA: Cuando se agrega a la mezcla de reacción, la concentración de anticuerpos se diluirá 1:1. Los tubos de dilución de anticuerpos están etiquetados como la concentración final de anticuerpos después de la adición a la reacción y, de hecho, contienen el doble de la cantidad de anticuerpos que la indicada en la etiqueta. Agregue 75 μL de PBS-TBN a todos los tubos de dilución de anticuerpos etiquetados como “500 μg/mL” e inferiores, incluidos los tubos de control “0 μg/mL” solo para vehículos. Para cada anticuerpo, pipetear 150 μL de la solución madre de 2.000 μg/mL en el tubo respectivo marcado como “1.000 μg/mL”. Esto se utilizará para hacer todas las diluciones posteriores para cada anticuerpo. Para cada anticuerpo, cree una serie completa de diluciones transfiriendo con pipeta 75 μL del tubo “1.000 μg/mL” al tubo con la siguiente dilución más baja de la serie (es decir, “500 μg/mL”). Cierre el tubo de dilución recién terminado, vérticelo brevemente y continúe la construcción de la serie de dilución transfiriendo 75 μL del tubo de “500 μg/mL” al tubo de “250 μg/mL”. Repita este patrón hasta que se haya realizado la última dilución, “8 μg/mL”, para todos los anticuerpos.NOTA: En la serie de dilución completa para cada anticuerpo, debe haber un volumen de 75 μL para todos los tubos, excepto la dilución más baja, 8 μg/mL, que debe contener un volumen de 150 μL. Cada reacción utilizará 25 μL de dilución de anticuerpos, por lo que estos volúmenes son suficientes para realizar cada reacción en pocillos duplicados por condición (es decir, 50 μL por condición), con extra para acomodar las pérdidas de pipeteo. Coloque 25 μL de los anticuerpos diluidos en los pocillos designados de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Diluir rhPD-L1 biotinilado a una concentración de trabajo de 4 μg/ml en PBS-TBN a un volumen suficiente para incluir 25 μl en pocillos duplicados por afección (es decir, 50 μl por afección), con un extra para acomodar las pérdidas de pipeteo.NOTA: En este trabajo, el rhPD-L1 biotinilado a 4 μg/mL dio como resultado aproximadamente el 50% de la señal máxima de MFI medida en la evaluación de acoplamiento anterior y se utilizó para el análisis de bloqueo de PD-1/PD-L1. Añadir 25 μL de rhPD-L1 biotinilado (4 μg/mL) a cada pocillo de reacción, cubrir la placa de microtitulación con una lámina o un sello adhesivo de plástico e incubar a RT (18-22 °C) durante 1 h agitando en un agitador de placas orbital a 600 rpm. Diluya las perlas acopladas a rhPD-1 a 50.000 perlas/ml, con un volumen suficiente para 50 μl/pocillo (2.500 perlas/pocillo) más extra para acomodar las pérdidas de pipeteo. Retire la placa de reacción de microtitulación de 96 pocillos del agitador y retire el sello de la placa adhesiva. Agregue 50 μL de la mezcla de perlas acopladas a rhPD-1 a cada pocillo. Sellar la placa e incubar durante 1 h en la oscuridad a RT (18-22 °C) en un agitador orbital a 600 rpm. Transfiera la placa sellada del agitador orbital al separador de placas magnéticas durante 2 minutos para inmovilizar las perlas. Retire con cuidado el sellador de placas adhesivas, confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien unidos, invierta la placa y vierta los sobrenadantes. Golpee suavemente la placa invertida sobre una almohadilla de papel absorbente para eliminar el exceso de sobrenadante. Lave el exceso de reactivos de reacción de las perlas.Retire la placa de microtitulación del separador de placas magnéticas y agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pocillo. Coloque la placa de microtitulación en el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para inmovilizar las perlas. Confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien unidos, invierta la placa y vierta los sobrenadantes. Golpee suavemente la placa invertida sobre una almohadilla de papel absorbente para eliminar el exceso de sobrenadante. Repita los pasos de lavado de placas 4.11.1-4.11.3 dos veces, para un total de tres lavados con PBS-TBN. Asegúrese de que el reactivo SAPE esté preparado (abajo) antes de retirar la solución de lavado final (tercera). Agregue el reactivo de detección SAPE.Diluir la solución madre SAPE a una concentración de trabajo de 6 μg/ml en PBS-TBN; hacer un volumen suficiente para 100 μL/pocillo, más extra para acomodar las pérdidas de pipeteo. Agregue 100 μL/pocillo de solución de trabajo SAPE en cada pocillo de reacción y vuelva a suspender las perlas mediante pipeteo. Sellar la placa e incubar durante 1 h en la oscuridad a RT (18-22 °C) en un agitador orbital a 600 rpm. Decantar el exceso de SAPE de la reacción.Transfiera la placa sellada del agitador orbital al separador de placas magnéticas durante 2 minutos para inmovilizar las perlas. Retire con cuidado el sellador de placas adhesivas, confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien unidos, invierta la placa y vierta el sobrenadante. Golpee suavemente la placa invertida sobre una almohadilla de papel absorbente para eliminar el sobrenadante que contiene el exceso de SAPE. Lave el exceso de SAPE de las cuentas.Retire la placa de microtitulación del soporte magnético de la placa. Agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pocillo para resuspender las perlas. Coloque la placa de microtitulación en el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para inmovilizar las perlas. Confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien unidos, invierta la placa y vierta el sobrenadante. Golpee suavemente la placa invertida sobre una almohadilla de papel absorbente para eliminar el exceso de sobrenadante. Realice dos pasos de lavado adicionales con PBS-TBN para un total de tres lavados repitiendo los pasos 4.15.1-4.15.4. Tenga preparados los anticuerpos de detección secundaria conjugados con BV421 (siguiente paso) antes de retirar la (tercera) solución de lavado final. Agregue los anticuerpos secundarios congominados con BV421.Diluir la IgG antihumana congugada con BV421 (para detectar anticuerpos de control humanizados) y la IgG anticonejo congugada con BV421 (para detectar anticuerpos policlonales inducidos por PDL1-Vaxx) (consulte la Tabla de materiales) 1:400 en tampón de lavado/ensayo a volúmenes suficientes para usar 100 μL/pocillo de cada uno, con un extra para acomodar las pérdidas de pipeteo. Añadir 100 μL de IgG antihumana conjugada con BV421 diluida o IgG anticonejo conjugada con BV421 a los pocillos apropiados. Sellar la placa e incubar durante 1 h en la oscuridad a RT (18-22 °C) en un agitador orbital a 600 rpm. Decantar el exceso de anticuerpos secundarios conjugados con BV421 de las perlas.Transfiera la placa sellada del agitador orbital al separador de placas magnéticas durante 2 minutos para inmovilizar las perlas. Retire con cuidado el sellador de placas adhesivas, confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien unidos, invierta la placa y vierta el sobrenadante. Golpee suavemente la placa invertida sobre una almohadilla de papel absorbente para eliminar el sobrenadante que contiene el exceso de anticuerpos secundarios conjugados con BV421. Lave el exceso de anticuerpos secundarios conjugados con BV421 de las perlas.Agregue 150 μL de PBS-TBN a cada pocillo para resuspender las perlas. Coloque la placa de microtitulación en el separador de placas magnéticas durante 2 minutos para inmovilizar las perlas. Confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien unidos, invierta la placa y vierta el sobrenadante. Golpee suavemente la placa invertida sobre una almohadilla de papel absorbente para eliminar el exceso de sobrenadante. Realice tres pasos de lavado adicionales con PBS-TBN para un total de cuatro lavados repitiendo los pasos 4.19.1-4.19.3. Después de retirar el último (cuarto) tampón de lavado, retire la placa de microtitulación del separador de placas magnéticas y vuelva a suspender las perlas en 100 μL PBS-TBN/pocillo con una pipeta. Analiza los resultados.Lea la placa en el sistema de análisis de flujo de doble reportero para determinar el MFI de cada reacción utilizando los siguientes ajustes del instrumento: volumen de aspiración = 50 μL; número mínimo de cuentas = 100 cuentas; ajuste de tiempo de espera = 40 s; Gate: 7.000-17.000; modo de funcionamiento = Dual Reporter. Con el sistema de doble reportero, asegúrese de que el canal reportero 1 mida la fluorescencia PE naranja (cantidad de rhPD-L1 unida a perlas conjugadas rhPD-1) y el canal reportero 2 mida la fluorescencia azul BV421 (cantidad de anticuerpo de bloqueo unido a rhPD-L1). Ejecute pozos duplicados para cada condición y promedie los dos valores de MFI de salida para cada condición antes de realizar más cálculos y gráficos de datos. Estandarice el valor de MFI de cada muestra al control negativo y calcule el porcentaje de inhibición para cada muestra:% de inhibición = (100 × [IMF de control negativo − MFI de muestra])/MFI de control negativoNOTA: Los valores de MFI de control negativo (sin inhibición) son los valores más altos; la MFI de la señal PD-L1 unida es del 100%, y la inhibición de la unión de rhPD-L1 a rhPD-1 se define como 0%. Figura 1: Esquema del ensayo de bloqueo PD-1/PD-L1 de doble reportero. La PD-L1 humana recombinante biotinilada (rhPD-L1) se preincuba con anticuerpos anti-PDL1 inducidos por PDL1-Vaxx seleccionados antes de combinarse con perlas magnéticas acopladas a rhPD-1 para permitir la formación del complejo de puntos de control PD-1/PD-L1. A continuación, se detecta el complejo rhPD-L1 y se marca mediante la adición de ficoeritrina acoplada a estreptavidina (SAPE, fluoróforo naranja). Los anticuerpos contra los epítopos de PDL1-Vaxx se dirigen a rhPD-L1 que se ha acomplejado con rhPD-1 preacoplado a las perlas magnéticas, y se iluminan utilizando un anticuerpo secundario conjugado con violeta brillante 421 (BV421, fluoróforo azul). Tanto los anticuerpos biotinilados rhPD-L1 que forman complejos con PD-1 (señal PE) como los anticuerpos anti-PDL1 que reconocen y se unen a rhPD-L1 (señal BV421) se analizan simultáneamente utilizando un instrumento citométrico de flujo reportero dual que interroga muestras de ambos fluoróforos en dos canales reporteros separados. Los valores de salida de cada muestra son la intensidad media de fluorescencia de cada fluoróforo. A continuación, se extrapola la inhibición de la formación del complejo PD1/PD-L1 por diferentes anticuerpos inducidos por PDL1-Vaxx comparando las señales experimentales con las generadas utilizando un anticuerpo monoclonal de control negativo que no se une a rhPD-L1 (0% de inhibición). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.