Magnetische fluorescerende kralen-gebaseerde dual-reporter flow-analyse van PDL1-Vaxx peptidevaccin-geïnduceerde antilichaamblokkade van de PD-1/PD-L1-interactie

1. Experimentele voorbereiding OPMERKING: De details van alle reagentia/apparatuur die in deze stap worden genoemd, staan vermeld in de materiaaltabel. Verkrijg recombinant humaan PD-1 (rhPD-1; polyhistidine-gelabeld). Reconstitueer gevriesdroogde rhPD1 met steriel gefilterde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, vóór gebruik. Verkrijg gebiotinyleerde recombinante humane PD-L1 (rhPD-L1). Reconstitueer gevriesdroogd rhPD-L1 met steriel gedeïoniseerd water voor gebruik. Verkrijg streptavidine-geconjugeerd R-phycoerythrin-detectiereagens (SAPE). Bewaar alle SAPE-oplossingen beschermd tegen licht bij koelkasttemperaturen (d.w.z. 2-8 °C). Verkrijg fluorescerend geverfde magnetische microbolletjes (6,5 μm diameter, polystyreen met ingebed magnetiet) en de Bead Coupling Kit15 (indien gebruikt, zie de Tabel met materialen). Covalente koppeling aan de microsferen vereist sulfo-NHS (sulfo-N-hydrosuccinimide) en EDC (N-[3-dimethylaminopropyl]-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride).OPMERKING: Magnetische kralensets zijn verkrijgbaar met een van de 500 unieke fluorescerende tags, die identificatie en differentiatie van verschillende kralensets mogelijk maken16. Kralen worden aangeboden in voorraadconcentraties van 2,5 × 106 kralen/ml en 12,5 × 106 kralen/ml. Bewaar de parels beschermd tegen licht bij koelkasttemperaturen (d.w.z. 2-8 °C). Vries de hielsuspensies niet in. Verkrijg positieve en negatieve controle-antilichamen en Brilliant Violet 421 (BV421)-gelabelde secundaire detectie-antilichamen. Bewaar alle fluorescerend geconjugeerde moleculen beschermd tegen licht. Voer alle koppelingsreacties uit in eiwitarme bindingsbuizen en alle analysereacties in laag-eiwitbindende microtiterplaten met ronde bodem en 96 putjes. Sluit de platen af met zelfklevende wegwerpfolie of plastic microplaatafdekkingen met 96 putjes voor de incubatiestappen van de test. Gebruik een magnetische platenscheider om de korrels te immobiliseren tijdens de wasstappen van de analyse.OPMERKING: Het stroomanalysesysteem met twee verslaggevers heeft drie lasers: (1) een die de specifieke fluorescentie van de parelset identificeert en kwantificeert (classificatiekanaal); (2) een die de doelspecifieke fycoerythrine (PE) fluorescentie detecteert en kwantificeert (Reporter Channel 1; 532 nm excitatie, “oranje” 565-585 nm emissie); en (3) een die de doelspecifieke BV421-fluorescentie van een tweede doelanalyt detecteert en kwantificeert (Reporter Channel 2; 405 nm excitatie, “blauwe” 421-441 nm emissie). 2. Koppeling rhPD-1 aan magnetische kralen OPMERKING: Het te koppelen eiwit moet vrij zijn van runderserumalbumine (BSA), natriumazide, glycine, glycerol, tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris) of aminebevattende additieven en moet bij pH 7,4 in PBS worden gesuspendeerd. Er is een in de handel verkrijgbare koppelingsset verkrijgbaar die alle benodigde reagentia en buffers bevat die hierin worden beschreven (zie de tabel met materialen). Haal alle koppelingsreagentia uit de koelkast en laat ze gedurende 20-30 minuten op kamertemperatuur komen (RT, 18-22 °C). Resuspendeer de standaard microsferen door kort te vortexen, te soniceren of te roteren (15 min bij 15-30 rpm), volgens het productinformatieblad. Breng 1 × 106 magnetische kralen over in een eiwitarm bindend microcentrifugebuisje van 1,5 ml (zie de materiaaltabel). Wasparels met 100 μL activeringsbuffer15: 0,1 M NaH2PO4 (monobasisch), pH 6,2.NOTITIE: Het koppelen kan ook worden uitgevoerd met behulp van een vooraf geconfigureerde koppelingsset, die 0.1 M 2-morfolinoethaansulfonzuur (MES), pH 6.0, bevat als alternatieve activerings- en koppelingsbuffer (zie de materiaaltabel).Plaats de tube met de kralen gedurende 1-2 minuten in een magnetische scheider.OPMERKING: Als alternatief kunnen de korrels worden gescheiden door microcentrifugatie bij ≥8.000 × g gedurende 1-2 minuten. Zuig het supernatans op met een pipet uit de met magneten geïmmobiliseerde of gepelleteerde parels terwijl het buisje nog in de magnetische scheider zit. Verwijder het microcentrifugebuisje van de magneet en voeg 80 μL koppelingsbuffer toe (zie de materiaaltabel). Draai de reactiebuis voorzichtig en soniceer gedurende 20 s om de kralen te verspreiden. Activeer de kralen met sulfo-NHS en EDC.OPMERKING: De voorraadoplossing van sulfo-NHS is 50 mg/ml opgelost in activeringsbuffer. De voorraadoplossing van EDC is ook 50 mg/ml opgelost in activeringsbuffer. Zowel de activeringsbuffer als het vocht in de atmosfeer veroorzaken EDC-afbraak. Het is niet aan te raden om opgeslagen EDC-oplossing te gebruiken. Maak net genoeg verse EDC-oplossing voor de stap en gebruik deze onmiddellijk als de oplossing klaar is. Gooi de overtollige EDC-oplossing weg.LET OP: EDC veroorzaakt ernstige oogirritatie en is irriterend voor de luchtwegen en de huid.Voeg 10 μL sulfo-NHS toe aan het microfugebuisje met de gewassen en geactiveerde korrels. Voeg 10 μL EDC-stockoplossing toe aan de microfuge-buis met de korrels en sulfo-NHS. Bescherm de lichtgevoelige microbolletjes tegen licht en draai de rotator gedurende 20 minuten bij 15-30 tpm, bij RT (18-22 °C). Als alternatief kan de buis tijdens de activeringsstap stationair blijven als deze zachtjes wordt gewerveld om de kralen met tussenpozen van 10 minuten te herverdelen. Was overtollige koppelingsreagentia van de parels.Plaats de buis met de geactiveerde kralen gedurende 1-2 minuten in een magnetische scheider. Zuig het supernatans op met een pipet uit met magneten geïmmobiliseerde of gepelleteerde parels met het buisje nog in de magnetische scheider. Verwijder het microcentrifugebuisje van de magneet en voeg 100 μL activeringsbuffer toe. Draai de reactiebuis voorzichtig om de kralen te verspreiden. Herhaal stap 2.6.1 tot en met 2.6.4 nog twee keer voor in totaal drie wasbeurten. Aan het einde van het wassen worden de korrels gesuspendeerd in 100 μL activeringsbuffer in een concentratie van ongeveer 10 × 106 korrels/ml. Koppel het rhPD-1 peptide aan de geactiveerde kralen.Voeg 390 μL activeringsbuffer toe aan het buisje met de geactiveerde korrels om het totale volume van de parelsuspensie op 490 μl te brengen. Voeg 1 μg PD-1-peptide toe aan de geactiveerde parelsuspensie door 10 μL PD-1-peptide-oplossing (1 mg/ml opgelost in PBS) toe te voegen aan het buisje met de geactiveerde korrels. Draai kort de microcentrifugebuis om de PD-1 en geactiveerde kralen gelijkmatig te verdelen. Incubeer de korrels met PD-1 gedurende 2 uur in het donker bij RT (18-22 °C) met rotatie (15-30 rpm). Was de kralen twee keer (2x) met behulp van Assay/Wash Buffer (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05% Tween-20 + 0,05% NaN315).Plaats de buis met de geactiveerde kralen gedurende 1-2 minuten in een magnetische scheider. Zuig het supernatans op met een pipet uit de met magneten geïmmobiliseerde of gepelleteerde parels terwijl het buisje nog in de magnetische scheider zit. Verwijder het microcentrifugebuisje van de magneet en voeg 100 μL activeringsbuffer toe. Draai de reactiebuis voorzichtig om de kralen te verspreiden. Herhaal stap 2.8.1-2.8.4 nog een keer voor in totaal twee wasbeurten. Aan het einde van het wassen worden de korrels gesuspendeerd in 100 μL activeringsbuffer in een concentratie van 10 × 106 korrels/ml.NOTITIE: De Assay/Wash-buffer kan worden gemaakt zonder natriumazide (conserveermiddel) als de buffer niet ook als opslagmedium wordt gebruikt. Bewaar de rhPD-1-gekoppelde kralen in het donker in de koelkast bij 2-8 °C als ze niet onmiddellijk worden gebruikt. Eiwitgekoppelde kralen zijn tot 18 maanden stabiel. 3. Evaluatie van succesvolle rhPD-1 koppeling aan de hielen OPMERKING: De rhPD-1-gekoppelde microsferen reageren met gebiotinyleerd rhPD-L1, waarvan de laatste wordt gedetecteerd door incubatie met SAPE, gevolgd door een beoordeling op de flowcytometer. Dit verifieert zowel de succesvolle PD-1-koppeling aan de magnetische kralen als de functionele interactie tussen de rhPD-1- en rhPD-L1-eiwitten. Maak een tweevoudige seriële verdunningsreeks van gebiotinyleerd rhPD-L1 in PBS-TBN (de standaard rhPD-L1-oplossing is 1 mg/ml). Het uiteindelijke te testen rhPD-L1-concentratiebereik is een oplossing van 8 μg/ml tot een oplossing van 313 pg/ml. Creëer volumes van 150 μl van elke rhPD-L1-verdunning: 50 μl voor elke reactie en twee reacties per conditie, plus voldoende overmaat om pipetteerverliezen op te vangen.Label de rhPD-L1 verdunningsmicrofugebuisjes als 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml, 0,125 μg/ml, 0,063 μg/ml en 0,031 μg/ml. Een buis van 0 μg/ml (alleen PBS-TBN) dient als de no-PD-L1-controle. Laad 150 μL PBS-TBN vooraf in alle gelabelde rhPD-L1-verdunningsbuisjes.OPMERKING: De hoogste uiteindelijke rhPD-L1-concentratie die moet worden getest, is 8 μg/ml en de rhPD-L1 wordt 1:1 verdund bij toevoeging aan het reactiemengsel, dus de verdunningsbuis met het label “8 μg/ml” verwijst naar de uiteindelijke concentratie en bevat in werkelijkheid 16 μg/ml rhPD-L1. De etiketten op alle verdunningsbuisjes geven de uiteindelijke rhPD-L1-concentratie aan na toevoeging aan de reactie. Creëer de hoogste concentratie rhPD-L1-verdunning (16 μg/ml werkelijk). Dit is een tweestaps, 62,5-voudige verdunning van de 1 mg/ml rhPD-L1-stockoplossing (1.000 μg/16 μg = 62,5).Combineer 84 μL PBS-TBN met 16 μL rhPD-L1-stockoplossing (1 mg/ml, d.w.z. 1.000 μL) in een microcentrifugebuis. Dit is een 6,25-voudige verdunning en de resulterende concentratie is 160 μg/ml rhPD-L1. Meng in het buisje met het label “8 μg/ml” 270 μL PBS-TBN met 30 μL van de rhPD-L1-verdunning die in de vorige stap is gecreëerd (160 μg/ml). Dit is een 10-voudige verdunning en de resulterende concentratie is eigenlijk 16 μg/ml. Het etiket van de buis “8 μg/ml” verwijst naar de uiteindelijke concentratie na toevoeging aan de reactie. Breng 150 μl van de rhPD-L1-verdunning die in stap 3.1.3 is gemaakt (“8 μg/ml”) over in de “4 μg/ml”-buis, sluit de dop van de microcentrifugebuis en draai kort om de oplossing te mengen. Herhaal stap 3.1.4 achtereenvolgens totdat de rhPD-L1-verdunningsreeks is voltooid. Na het maken moeten alle buisjes tussen “8 μg/ml” en “0,063 μg/ml”, evenals de 0 μg/ml-controle, 150 μl oplossing bevatten en het laatste buisje, “0,031 μg/ml”, moet 300 μl oplossing bevatten. Hierdoor ontstaat een voldoende volume van elke verdunning om 50 μL van elke gebiotinyleerde rhPD-L1-verdunning in dubbele reacties te testen, waarbij voldoende overschot overblijft om pipetteerverliezen op te vangen. Tel de rhPD-1-gekoppelde kralen met behulp van een hemocytometer17. Verdun de voorraad rhPD-1-gekoppelde korrels tot 5 × 104 korrels/ml, met een volume dat voldoende is voor 2.500 korrels/50 μl/reactie. Draai de 5 × 104 kralen/ml rhPD-1-gekoppelde parelsuspensie en pipetteer 50 μL van de suspensie in elk gelabeld/in kaart gebracht putje van een microtiterplaat met ronde bodem met 96 putjes, zodat er dubbele putjes worden gemaakt voor elke rhPD-L1-verdunning die wordt getest. Voeg 50 μl van elke gebiotinyleerde rhPD-L1-verdunningsbuis die in stap 3.1 is gemaakt, toe aan de daarvoor bestemde putjes op de microtiterplaat. Bedek de microtiterplaat met een wegwerpfolie of plastic zelfklevende plaatsealer en incubeer de plaat gedurende 1 uur in het donker bij RT (18-22 °C) op een orbitale schudder (600 rpm). Was overtollig gebiotinyleerd rhPD-L1 van de korrels.Breng de verzegelde plaat gedurende 2 minuten over van de orbitale schudder naar de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren. Verwijder voorzichtig de zelfklevende plaatafdichter, controleer of de magneet en de microtiterplaat stevig bij elkaar zitten, keer de plaat om en gooi de supernatanten in een gootsteen of een container voor vloeibaar afval voor biologisch gevaarlijk afval, indien van toepassing. Tik zachtjes maar stevig op de omgekeerde plaat op een kussen van absorberend papieren zakdoekje om het resterende supernatant te verwijderen. Verwijder de microtiterplaat uit de magnetische platenscheider en pipetteer 150 μL PBS-TBN in elk putje. Plaats de niet-verzegelde plaat gedurende 2 minuten op de magnetische scheider om de kralen te immobiliseren. Controleer of de magneet en de microtiterplaat stevig bij elkaar zitten, keer de plaat om en gooi de supernatanten in een gootsteen of een container voor vloeibaar afval voor biologisch gevaarlijk afval, indien van toepassing. Tik zachtjes maar stevig op de omgekeerde plaat op een kussen van absorberend papieren zakdoekje om het resterende supernatant te verwijderen. Herhaal de bordenwasstappen 3.7.3-3.7.5 twee keer voor in totaal drie wasbeurten met elk 150 μl PBS-TBN. Zorg ervoor dat er aan het einde van de laatste wasstap geen supernatans in de putjes achterblijft. Werk gestaag om te voorkomen dat de geïmmobiliseerde kralen op de bodem van de put uitdrogen. Voeg SAPE-detectiereagens toe.Verdun de SAPE-stockoplossing in PBS-TBN tot een werkconcentratie van 6 μg/ml. Bereid een voldoende SAPE-werkoplossingsvolume voor, zodat alle reactieputjes 100 μl/putje kunnen ontvangen, met voldoende extra om pipetteerverliezen op te vangen. Verwijder de microtiterplaat van de magnetische platenscheider. Voeg 100 μl SAPE-werkoplossing toe aan elk reactieputje en resuspendeer de gewassen korrels door middel van pipetteren. Sluit de microtiterplaat met 96 putjes af met een folie of plastic zelfklevende plaatsealer en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij RT (18-22 °C) op een orbitale schudder bij 600 tpm. Verwijder de microtiterplaat uit de incubator, breng deze over naar de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren, verwijder de zelfklevende plaatsealer en was de korrels driemaal met 150 μL PBS-TBN, zoals beschreven in de stappen 3.7.3-3.7.5. Verwijder na het verwijderen van de laatste wasbeurt de plaat uit de magnetische platenscheider en resuspendeer de kralen in 100 μL PBS-TBN per putje. Analyseer de resultaten.Lees de plaat op het flowanalyse-instrument (zie de materiaaltabel) om de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van elke reactie te bepalen met behulp van de volgende instrumentinstellingen: aspiratievolume = 50 μL; minimum aantal kralen = 100 kralen; time-outinstelling = 40 s; gating = 7.000-17.000; bedrijfsmodus = Single Reporter. Voor elke voorwaarde worden dubbele putten uitgevoerd en de twee MFI-uitgangswaarden voor elke voorwaarde worden gemiddeld voordat verdere gegevensberekeningen en grafieken worden uitgevoerd.OPMERKING: De MFI-waarde van elke verdunning moet een concentratieafhankelijke binding vertonen, wat wijst op een acceptabele rhPD-1-koppelingsefficiëntie aan de korrels en een goede interactie van de recombinante PD-1/PD-L1-eiwitten bevestigt. 4. PD-L1 magnetische kraal-gebaseerde PD-1/PD-L1 blokkerende test OPMERKING: Deze test beoordeelt de blokkerende activiteit van oplosbare mediatoren (bijv. anti-PDL1-peptide-antilichamen) op recombinante PD1/PD-L1-interacties. In het kort wordt gebiotinyleerd rhPD-L1 gepreïncubeerd met antilichamen die bij konijnen worden gegenereerd na verschillende PDL1-Vaxx-peptide-inentingen. Het rhPD-L1 + anti-PDL1-antilichaammengsel wordt vervolgens opgevangen met behulp van rhPD-1-gekoppelde magnetische kralen en de rhPD-L1-binding aan de rhPD-1-gekoppelde kralen wordt gekwantificeerd door toevoeging van streptavidine-PE. Het PE-fluorescentiesignaal correleert omgekeerd evenredig met de blokkerende activiteit van de geteste anti-PDL1-antilichamen/remmers. Anti-PDL1-peptide-antilichaambinding wordt tegelijkertijd beoordeeld door de binding van een BV421-gekoppeld anti-konijn (voor anti-PDL1-peptide-antilichamen) of anti-humaan (voor controle-antilichamen) secundair antilichaam en door evaluatie van de BV421-fluorescentie in het tweede kanaal van het instrument. De analysestappen zijn geïllustreerd in figuur 1. Bereid een tweevoudige seriële verdunningsreeks van de testantilichamen voor, waaronder PDL1-Vaxx-geïnduceerde polyklonale antilichaamkandidaten, een negatief controle-antilichaam (trastuzumab, Herceptin, gehumaniseerd anti-HER2 monoklonaal antilichaam) en een positief controle-antilichaam (atezolizumab; gehumaniseerd anti-PDL1 IgG1 monoklonaal antilichaam). Bij elke reactie wordt 25 μL van de toegewezen antilichaamverdunning gebruikt, dus de getoonde volumes zijn voldoende om elke reactie in dubbele putjes per conditie uit te voeren (d.w.z. 50 μL per conditie), waarbij er wat overschot overblijft om pipetteerverliezen op te vangen.Zorg ervoor dat voor elk vaccingeïnduceerd anti-PDL1-peptide-antilichaam en controle-antilichaam het bereik van de uiteindelijk geteste antilichaamconcentraties varieert van 1.000 μg/ml tot 8 μg/ml. Bereid stockoplossingen van alle antilichamen in een dosis van 2.000 μg/ml. Label voor elk antilichaam de verdunningsbuisjes als 1.000 μg/ml, 500 μg/ml, 250 μg/ml, 125 μg/ml, 63 μg/ml, 31 μg/ml, 16 μg/ml en 8 μg/ml en vermeld de naam van het antilichaam. Voeg voor elk antilichaam ook een “0 μg/ml”-buis toe, die de medium-only (PBS-TBN) controle zal zijn.OPMERKING: Wanneer toegevoegd aan het reactiemengsel, wordt de antilichaamconcentratie 1:1 verdund. De antilichaamverdunningsbuisjes zijn gelabeld als de uiteindelijke antilichaamconcentratie na toevoeging aan de reactie en bevatten in feite twee keer zoveel antilichaam als gelabeld. Voeg 75 μL PBS-TBN toe aan alle antilichaamverdunningsbuisjes met het label “500 μg/ml” en lager, inclusief de “0 μg/ml” controlebuisjes voor alleen voertuigen. Pipetteer voor elk antilichaam 150 μL van de 2.000 μg/ml stockoplossing in het betreffende buisje met het label “1.000 μg/ml”. Dit zal worden gebruikt om alle volgende verdunningen voor elk antilichaam te maken. Maak voor elk antilichaam een volledige verdunningsreeks door 75 μl van het buisje “1.000 μg/ml” over te brengen naar het buisje met de eerstvolgende lagere verdunning in de reeks (d.w.z. “500 μg/ml”). Sluit de pas voltooide verdunningsbuis, draai deze kort en ga verder met de constructie van de verdunningsreeks door 75 μL over te brengen van de “500 μg/ml”-buis naar de “250 μg/ml”-buis. Herhaal dit patroon totdat de laatste verdunning, “8 μg/ml”, is gemaakt voor alle antilichamen.OPMERKING: In de voltooide verdunningsreeks voor elk antilichaam moet er een volume van 75 μl zijn voor alle buisjes, behalve de laagste verdunning, 8 μg/ml, die een volume van 150 μl moet bevatten. Bij elke reactie wordt 25 μL antilichaamverdunning gebruikt, dus deze volumes zijn voldoende om elke reactie in dubbele putjes per conditie uit te voeren (d.w.z. 50 μL per conditie), met extra om pipetteerverliezen op te vangen. Breng 25 μL van de verdunde antilichamen in de daarvoor bestemde putjes van een microtiterplaat met 96 putjes. Verdun gebiotinyleerd rhPD-L1 tot een werkconcentratie van 4 μg/ml in PBS-TBN in een volume dat voldoende is om 25 μl in dubbele putjes per conditie op te nemen (d.w.z. 50 μl per conditie), met extra om pipetteerverliezen op te vangen.OPMERKING: In dit werk resulteerde gebiotinyleerd rhPD-L1 bij 4 μg/ml in ongeveer 50% van het maximale MFI-signaal gemeten in de eerdere koppelingsevaluatie en werd het gebruikt voor de PD-1/PD-L1-blokkadeanalyse. Voeg 25 μl gebiotinyleerd rhPD-L1 (4 μg/ml) toe aan elk reactieputje, bedek de microtiterplaat met een folie of plastic zelfklevende afdichting en incubeer gedurende 1 uur bij RT (18-22 °C) met schudden op een orbitale plaatschudder bij 600 tpm. Verdun de rhPD-1-gekoppelde korrels tot 50.000 korrels/ml, met een voldoende volume voor 50 μl/putje (2.500 korrels/putje) plus extra om pipetteerverliezen op te vangen. Verwijder de 96-wells microtiter-reactieplaat van de shaker en verwijder de zelfklevende plaatafdichting. Voeg 50 μL van het rhPD-1-gekoppelde parelmengsel toe aan elk putje. Sluit de plaat af en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij RT (18-22 °C) op een orbitale schudder bij 600 tpm. Breng de verzegelde plaat gedurende 2 minuten over van de orbitale schudder naar de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren. Verwijder voorzichtig de zelfklevende plaatafdichter, controleer of de magneet en de microtiterplaat stevig bij elkaar zitten, keer de plaat om en dump de supernatanten. Tik de omgekeerde plaat voorzichtig op een kussen van absorberend papieren zakdoekje om overtollig supernatant te verwijderen. Was overtollige reactiereagentia van de korrels.Verwijder de microtiterplaat van de magnetische platenscheider en voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elk putje. Plaats de microtiterplaat gedurende 2 minuten op de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren. Controleer of de magneet en de microtiterplaat stevig bij elkaar zitten, keer de plaat om en dump de supernatanten. Tik de omgekeerde plaat voorzichtig op een kussen van absorberend papieren zakdoekje om overtollig supernatant te verwijderen. Herhaal de bordenwasstappen 4.11.1-4.11.3 twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten met PBS-TBN. Zorg ervoor dat het SAPE-reagens is voorbereid (hieronder) voordat u de laatste (derde) wasoplossing verwijdert. Voeg het SAPE-detectiereagens toe.Verdun de SAPE-stockoplossing tot een werkconcentratie van 6 μg/ml in PBS-TBN; voldoende volume voor 100 μL/putje, plus extra om pipetteerverliezen op te vangen. Voeg 100 μL/putje SAPE-werkoplossing toe aan elk reactieputje en resuspendeer de korrels door middel van pipetteren. Sluit de plaat af en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij RT (18-22 °C) op een orbitale schudder bij 600 tpm. Decanteer het teveel aan SAPE uit de reactie.Breng de verzegelde plaat gedurende 2 minuten over van de orbitale schudder naar de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren. Verwijder voorzichtig de zelfklevende plaatafdichter, controleer of de magneet en de microtiterplaat stevig bij elkaar zitten, keer de plaat om en dump het supernatant. Tik de omgekeerde plaat voorzichtig op een kussen van absorberend papieren zakdoekje om het supernatans met overtollig SAPE te verwijderen. Was het overtollige SAPE van de kralen.Verwijder de microtiterplaat uit de magnetische plaathouder. Voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elk putje om de kralen opnieuw te suspenderen. Plaats de microtiterplaat gedurende 2 minuten op de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren. Controleer of de magneet en de microtiterplaat stevig bij elkaar zitten, keer de plaat om en dump het supernatant. Tik de omgekeerde plaat voorzichtig op een kussen van absorberend papieren zakdoekje om overtollig supernatant te verwijderen. Voer twee extra wasstappen uit met PBS-TBN voor een totaal van drie wasbeurten door stap 4.15.1-4.15.4 te herhalen. Laat de BV421-gecongugeerde secundaire detectie-antilichamen voorbereiden (volgende stap) voordat u de laatste (derde) wasoplossing verwijdert. Voeg de BV421-gecongugeerde secundaire antilichamen toe.Verdun BV421-gecongugeerd anti-humaan IgG (voor het detecteren van gehumaniseerde controle-antilichamen) en BV421-gecongugeerd anti-konijn IgG (voor het detecteren van PDL1-Vaxx-geïnduceerde polyklonale antilichamen) (zie de materiaaltabel) 1:400 in was-/analysebuffer bij volumes die voldoende zijn voor het gebruik van 100 μL/putje van elk, met extra om pipetteerverliezen op te vangen. Voeg 100 μL verdund BV421-geconjugeerd anti-humaan IgG of BV421-geconjugeerd anti-konijn IgG toe aan de daarvoor bestemde putjes. Sluit de plaat af en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij RT (18-22 °C) op een orbitale schudder bij 600 tpm. Decanteer de overtollige BV421-geconjugeerde secundaire antilichamen uit de korrels.Breng de verzegelde plaat gedurende 2 minuten over van de orbitale schudder naar de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren. Verwijder voorzichtig de zelfklevende plaatafdichter, controleer of de magneet en de microtiterplaat stevig bij elkaar zitten, keer de plaat om en dump het supernatant. Tik de omgekeerde plaat voorzichtig op een kussen van absorberend papieren zakdoekje om het supernatans met overtollige BV421-geconjugeerde secundaire antilichamen te verwijderen. Was de overtollige BV421-geconjugeerde secundaire antilichamen uit de korrels.Voeg 150 μL PBS-TBN toe aan elk putje om de kralen opnieuw te suspenderen. Plaats de microtiterplaat gedurende 2 minuten op de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren. Controleer of de magneet en de microtiterplaat stevig bij elkaar zitten, keer de plaat om en dump het supernatant. Tik de omgekeerde plaat voorzichtig op een kussen van absorberend papieren zakdoekje om overtollig supernatant te verwijderen. Voer drie extra wasstappen uit met PBS-TBN voor een totaal van vier wasbeurten door stap 4.19.1-4.19.3 te herhalen. Verwijder na het verwijderen van de laatste (vierde) wasbuffer de microtiterplaat van de magnetische platenscheider en resuspendeer de korrels in 100 μL PBS-TBN/wells met een pipettor. Analyseer de resultaten.Lees de plaat af op het flowanalysesysteem met dubbele verslaggever om de MFI van elke reactie te bepalen met behulp van de volgende instrumentinstellingen: aspiratievolume = 50 μL; minimum aantal kralen = 100 kralen; time-outinstelling = 40 s; gating: 7.000-17.000; bedrijfsmodus = Dual Reporter. Zorg er met het dual-reporter-systeem voor dat Reporter Channel 1 de oranje PE-fluorescentie meet (hoeveelheid rhPD-L1 bevestigd aan rhPD-1-geconjugeerde kralen) en Reporter Channel 2 de blauwe BV421-fluorescentie meet (hoeveelheid aangehecht blokkerend antilichaam gebonden aan rhPD-L1). Voer dubbele putten uit voor elke voorwaarde en neem het gemiddelde van de twee MFI-waarden voor elke voorwaarde voordat u verdere gegevensberekeningen en grafieken uitvoert. Standaardiseer de MFI-waarde van elk monster naar de negatieve controle en bereken het remmingspercentage voor elk monster:Remming% = (100 × [MFI met negatieve controle − MFI met steekproef])/MFI met negatieve controleOPMERKING: De negatieve MFI-waarden van de controle (geen remming) zijn de hoogste waarden; de gebonden PD-L1-signaal-MFI is 100% en de remming van rhPD-L1-binding aan rhPD-1 wordt gedefinieerd als 0%. Figuur 1: Schema van de dual-reporter PD-1/PD-L1 blokkadetest. Gebiotinyleerde recombinante humane PD-L1 (rhPD-L1) wordt vooraf geïncubeerd met geselecteerde PDL1-Vaxx-geïnduceerde anti-PDL1-antilichamen voordat ze worden gecombineerd met rhPD-1-gekoppelde magnetische kralen om PD-1/PD-L1-checkpointcomplexvorming mogelijk te maken. Gecomplexeerd rhPD-L1 wordt vervolgens gedetecteerd en gemarkeerd door de toevoeging van streptavidine-gekoppeld phycoerythrine (SAPE, oranje fluorofoor). Antilichamen tegen PDL1-Vaxx-epitopen richten zich op rhPD-L1 dat is gecomplexeerd tot rhPD-1 dat vooraf is gekoppeld aan de magnetische kralen, en ze worden verlicht met behulp van een Brilliant Violet 421-geconjugeerd secundair antilichaam (BV421, blauwe fluorofoor). Zowel gebiotinyleerd rhPD-L1 dat is gecomplexeerd tot PD-1 (PE-signaal) als anti-PDL1-antilichamen die het rhPD-L1 (BV421-signaal) herkennen en binden, worden gelijktijdig geanalyseerd met behulp van een dual-reporter flowcytometrisch instrument dat monsters voor beide fluoroforen ondervraagt in twee afzonderlijke reporterkanalen. De uitgangswaarden voor elk monster zijn de mediane fluorescentie-intensiteit van elke fluorofoor. De remming van de vorming van PD1/PD-L1-complex door verschillende PDL1-Vaxx-geïnduceerde antilichamen wordt vervolgens geëxtrapoleerd door de experimentele signalen te vergelijken met de signalen die worden gegenereerd met behulp van een negatief monoklonaal controle-antilichaam dat rhPD-L1 niet bindt (0% remming). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.