تحليل تدفق المراسل المزدوج القائم على حبة الفلورسنت المغناطيسية لحصار الأجسام المضادة الناجم عن لقاح الببتيد PDL1-Vaxx لتفاعل PD-1 / PD-L1
Summary
مثبطات نقاط التفتيش هي أهداف مهمة في تطوير علاجات للمعركة ضد السرطان. يقدم هذا التقرير لقاحا جديدا للسرطان قائم على الببتيد PDL1 ، PDL1-Vaxx ، والذي يحفز على تحييد إنتاج الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي تمنع تكوين مركب PD-1 / PDL1. يوضح هذا العمل أيضا تطوير واختبار مقايسة قائمة على حبة الفلورسنت لتحليل هذا النشاط.
Abstract
أظهر تثبيط مستقبلات نقاط التفتيش (PD-1 و PD-L1 و CTLA-4) بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة فائدة كبيرة في التجارب السريرية لعلاج مرضى السرطان وأصبح نهجا أساسيا في العلاج المناعي الحديث للسرطان. ومع ذلك ، فإن مجموعة فرعية فقط من المرضى تستجيب للعلاج المناعي للأجسام المضادة وحيدة النسيلة عند نقطة التفتيش. لذلك ، من الملح تطوير استراتيجيات علاجية جديدة ضد السرطان. تم تطوير لقاح جديد للسرطان من ببتيد الخلايا البائية PDL1 (رابط الموت المبرمج 1) ، مع الأحماض الأمينية 130-147 المرتبطة بببتيد MVF (“بروتين اندماج فيروس الحصبة في الخلايا التائية المختلطة”) عبر رابط GPSL. أشارت الاختبارات قبل السريرية إلى أن لقاح PDL1 (PDL1-Vaxx) يحفز بشكل فعال الأجسام المضادة عالية المناعة في. تظهر المحصنة ب PDL1-Vaxx انخفاضا في عبء الورم ومعدلات بقاء ممتدة في نماذج مختلفة من سرطان. تشير آليات العمل إلى أن الأجسام المضادة المستحثة باللقاحات تمنع تكاثر الخلايا السرطانية ، وتحفز موت الخلايا المبرمج ، وتمنع تفاعل PD-1 / PD-L1. تقدم هذه المخطوطة مقايسة قائمة على الخرزة المغناطيسية تستخدم نظام تحليل تدفق المراسل المزدوج لتقييم تفاعل PD-1 / PD-L1 وحصاره بواسطة الأجسام المضادة المضادة ل PDL1 المرفوعة ضد PDL1-Vaxx.
Introduction
في الخلايا التائية والخلايا البائية ونقاط التفتيش داخل الخلايا في الجهاز المناعي ، تنظم مسارات الإشارات أنشطة المناعة. تحمي بعض الخلايا السرطانية نفسها من الهجوم المناعي عن طريق تحفيز أهداف نقاط التفتيش ، والتي تمنع وظيفة المناعة وتعزز بقاء الأورام وتكاثرها. يستخدم العلاج المناعي للأورام عن طريق تثبيط نقاط التفتيش الأجسام المضادة لاستهداف نقاط التفتيش التي تشير ومنعها ، وبالتالي استعادة الوظائف المضادة للأورام في الجهاز المناعي1،2،3. تشمل العلاجات المضادة للسرطان عالية الفعالية حاليا الأجسام المضادة وحيدة النسيلة نيفولوماب ، التي تستهدف بروتين الموت المبرمج 1 (PD-1) 4 ، وأتيزوليزوماب ، الذي يستهدف ليجند الموت المبرمج 1 (PD-L1) 5. وقد أظهر هذا النهج نجاحا سريريا كبيرا في علاج مرضى السرطان. ومع ذلك ، يتم تخفيف الفائدة السريرية لاستراتيجيات تثبيط نقاط التفتيش الحالية من خلال الأحداث الضائرة ومقاومة العلاج ، خاصة في العلاج أحادي العامل6. هناك حاجة ماسة إلى مزيج من العلاج المناعي والاستراتيجيات العلاجية الأكثر فعالية مع سمية أقل في علاج السرطان1،3،6.
على مدى السنوات ال 30 الماضية ، طور مختبر الدكتور كومايا لقاحات سرطان الببتيد والعوامل المرتبطة بتقليد الببتيد لعلاج السرطان ، وبعضها في التجارب السريرية الجارية1،2،7،8،9،10،11،12،13،14. على سبيل المثال ، أظهر B-Vaxx مع العلاج المناعي المركب HER-2 فوائد للمرضى ضد الأورام الصلبة النقيلية و / أو المتكررة في التجارب السريرية12. أحدث لقاحات السرطان في المختبر هي PD1-Vaxx 2,13 و PDL1-Vaxx14 ، والتي أظهرت مزايا كبيرة في الدراسات قبل السريرية ، وخاصة في العلاج المركب. أكمل PD1-Vaxx التجارب السريرية لتصعيد الجرعة في الولايات المتحدة وأستراليا. سيتم دمج PD1-Vaxx مع أتيزوليزوماب في تجربة المرحلة 1 ب التي ستبدأ في مايو 2023. يركز هذا التقرير على تقييم قدرة الأجسام المضادة التي يسببها PDL1-Vaxx على منع تفاعل PD-1 / PD-L1.
لقاح السرطان PDL1-Vaxx هو لقاح جديد لببتيد الخلايا البائية مع الأحماض الأمينية PD-L1 130-147 المرتبطة بببتيد اندماج فيروس الحصبة في الخلايا التائية (MVF) عبر رابط الببتيد GPSL. أظهرت الدراسات قبل السريرية أن PDL1-Vaxx مناعي للغاية في تحفيز إنتاج الأجسام المضادة المضادة للسرطان في نماذج حيوانية مختلفة ، ويطيل البقاء على قيد الحياة ، ويقلل من عبء الورم14. يمكن لهذه الأجسام المضادة المتولدة ضد الببتيد PD-L1 أن تمنع بنجاح تفاعل PD1 / PD-L1 ، مما يؤدي إلى نشاط مضاد للأورام. يقدم هذا التقرير مقايسة تحلل الحصار المفروض على تكوين مركب PD1 / PD-L1 بواسطة الأجسام المضادة التي يسببها PDL1-Vaxx باستخدام تنسيق قائم على حبة مغناطيسية مع قراءة مزدوجة المراسل على أداة قياس التدفق الخلوي.
Protocol
1. التحضير التجريبي ملاحظة: يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف / المعدات المذكورة في هذه الخطوة في جدول المواد. الحصول على PD-1 البشري المؤتلف (rhPD-1 ؛ علامة polyhistidine). إعادة تكوين rhPD1 المجفف بالتجميد مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات المصفى المعقم (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، قبل الاستخدام. الحصول على PD-L1 البشري المؤتلف البيوتينيل (rhPD-L1). أعد تكوين rhPD-L1 المجفف بالتجميد بالماء منزوع الأيونات المعقم قبل الاستخدام. الحصول على كاشف الكشف عن R-phycoerythrin المترافق بالستربتافيدين (SAPE). قم بتخزين جميع محاليل SAPE المحمية من الضوء في درجات حرارة الثلاجة (أي 2-8 درجة مئوية). احصل على كريات مجهرية مغناطيسية مصبوغة بالفلورسنت (قطر 6.5 ميكرومتر ، بوليسترين مع مغنتيت مدمج) ومجموعة اقتران الخرز15 (إذا تم استخدامها ، انظر جدول المواد). يتطلب الاقتران التساهمي بالكرات المجهرية سلفو-NHS (سلفو-N-هيدروسكسينيميد) و EDC (N- [3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل]-N′-إيثيل كاربوديميد هيدروكلوريد).ملاحظة: تتوفر مجموعات الخرز المغناطيسي مع أي من 500 علامة فلورسنت فريدة ، مما يسمح بتحديد الهوية والتمايز عن مجموعات الخرز المختلفة16. يتم تقديم الخرز بتركيزات مخزون تبلغ 2.5 × 106 حبات / مل و 12.5 × 106 حبات / مل. قم بتخزين الخرز المحمي من الضوء في درجات حرارة الثلاجة (أي 2-8 درجة مئوية). لا تجمد تعليق الخرزة. احصل على الأجسام المضادة للتحكم الإيجابي والسلبي والأجسام المضادة للكشف الثانوي المسمى Brilliant Violet 421 (BV421). قم بتخزين جميع جزيئات الفلورسنت المترافقة المحمية من الضوء. قم بإجراء جميع تفاعلات الاقتران في أنابيب الربط منخفضة البروتين وجميع تفاعلات الفحص في ألواح الربط منخفضة البروتين والمستديرة القاع و 96 بئرا. أغلق الألواح بورق لاصق يمكن التخلص منه أو أغطية بلاستيكية ذات 96 بئرا لخطوات حضانة الفحص. استخدم فاصل الألواح المغناطيسية لشل حركة الخرز أثناء خطوات غسل الفحص.ملاحظة: يحتوي نظام تحليل التدفق ثنائي المراسل على ثلاثة ليزر: (1) واحد يحدد ويحدد التألق الخاص بمجموعة الخرزات (قناة التصنيف) ؛ (2) واحد يحدد ويحدد كمية التألق الخاص بمجموعة الخرزات (قناة التصنيف) ؛ (2) واحد يحدد ويحدد كمية التألق الخاص بمجموعة الخرزات (قناة التصنيف) ؛ (2) واحد يحدد ويحدد كمية التألق الخاص بمجموعة الخرزات (قناة التصنيف) ؛ (2) واحد يحدد ويحدد كميا التألق الخاص بمجموعة الخرزات (قناة التصنيف) ؛ (2) واحد يحدد ويحدد كميا التألق (2) واحد يكتشف ويحدد مضان phycoerythrin (PE) الخاص بالهدف (قناة المراسل 1 ؛ إثارة 532 نانومتر ، انبعاث “برتقالي” 565-585 نانومتر) ؛ و (3) واحد يكتشف ويحدد مضان BV421 الخاص بالهدف لتحليل الهدف الثاني (قناة المراسل 2 ؛ إثارة 405 نانومتر ، انبعاث “أزرق” 421-441 نانومتر). 2. اقتران rhPD-1 بالخرز المغناطيسي ملاحظة: يجب أن يكون البروتين المراد إقرانه خاليا من ألبومين مصل الأبقار (BSA) أو أزيد الصوديوم أو الجلايسين أو الجلسرين أو تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان (Tris) أو المضافات المحتوية على الأمين ويجب تعليقه في برنامج تلفزيوني عند درجة الحموضة 7.4. تتوفر مجموعة أدوات اقتران تجارية تتضمن جميع الكواشف والمخازن المؤقتة اللازمة الموضحة هنا (انظر جدول المواد). قم بإزالة جميع كواشف التوصيل من الثلاجة ، واتركها تتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT ، 18-22 درجة مئوية) لمدة 20-30 دقيقة. أعد تعليق الكريات المجهرية للمخزون عن طريق الدوامة أو الصوتنة أو الدوران لفترة وجيزة (15 دقيقة عند 15-30 دورة في الدقيقة) ، وفقا لورقة معلومات المنتج. نقل 1 × 106 حبات مغناطيسية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين سعة 1.5 مل (انظر جدول المواد). اغسل الخرز ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقتللتنشيط 15: 0.1 M NaH2PO4 (أحادي القاعدية) ، درجة الحموضة 6.2.ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الاقتران باستخدام مجموعة اقتران مكونة مسبقا ، والتي تتضمن 0.1 M 2-مورفولينوإيثان سلفونيك (MES) ، الرقم الهيدروجيني 6.0 ، كمخزن مؤقت بديل للتنشيط والاقتران (انظر جدول المواد).ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات في فاصل مغناطيسي لمدة 1-2 دقيقة.ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن فصل الخرزات عن طريق الطرد المركزي الدقيق عند ≥8000 × جم لمدة 1-2 دقيقة. نضح المادة الطافية باستخدام ماصة من الخرز المثبت بالمغناطيس أو المحبب مع الأنبوب الذي لا يزال موضوعا في الفاصل المغناطيسي. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الدقيق من المغناطيس ، وأضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاقتران (انظر جدول المواد). دوامة أنبوب التفاعل برفق ، وصوتنة لمدة 20 ثانية لتفريق الخرز. تنشيط الخرز مع السلفو NHS و EDC.ملاحظة: محلول مخزون السلفو-NHS هو 50 مجم / مل مذاب في مخزن التنشيط. محلول مخزون EDC هو أيضا 50 مجم / مل مذاب في مخزن التنشيط. يتسبب كل من مخزن التنشيط المؤقت والرطوبة في الغلاف الجوي في تدهور EDC. لا ينصح باستخدام محلول EDC المخزن. اصنع ما يكفي من محلول EDC الطازج قبل الخطوة ، واستخدمه على الفور عندما يكون المحلول جاهزا. تخلص من محلول EDC الزائد.تنبيه: يسبب EDC تهيجا شديدا للعين وهو مهيج للجهاز التنفسي والجلد.أضف 10 ميكرولتر من السلفو-NHS إلى أنبوب الميكروفوج الذي يحتوي على الخرزات المغسولة والمنشطة. أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون EDC إلى أنبوب الميكروفوج الذي يحتوي على الخرزات والسلفو-NHS. احم الكريات المجهرية الحساسة للضوء من الضوء ، وقم بتدويرها على الدوار لمدة 20 دقيقة عند 15-30 دورة في الدقيقة ، عند RT (18-22 درجة مئوية). بدلا من ذلك ، يمكن أن يظل الأنبوب ثابتا أثناء خطوة التنشيط إذا تم تحريكه بلطف لإعادة توزيع الخرزات على فترات 10 دقائق. اغسل كواشف التوصيل الزائدة من الخرز.ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات المنشطة في فاصل مغناطيسي لمدة 1-2 دقيقة. نضح المادة الطافية باستخدام ماصة من حبات مثبتة بالمغناطيس أو محببة مع الأنبوب الذي لا يزال موضوعا في الفاصل المغناطيسي. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الدقيق من المغناطيس ، وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتنشيط. دوامة أنبوب التفاعل بلطف لتفريق الخرز. كرر الخطوات 2.6.1-2.6.4 مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات. في نهاية الغسيل ، سيتم تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من مخزن التنشيط بتركيز تقريبي يبلغ 10 × 106 حبات / مل. قم بإقران الببتيد rhPD-1 بالخرز المنشط.أضف 390 ميكرولتر من مخزن التنشيط المؤقت إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات المنشطة ليصل إجمالي حجم تعليق الخرزة إلى 490 ميكرولتر. أضف 1 ميكروغرام من ببتيد PD-1 إلى معلق الخرزة المنشط عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من محلول الببتيد PD-1 (1 مجم / مل مذاب في PBS) إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات المنشطة. دوامة لفترة وجيزة أنبوب الطرد المركزي الدقيق لتوزيع PD-1 بشكل موحد والخرز المنشط. احتضان الخرز مع PD-1 لمدة 2 ساعة في الظلام عند RT (18-22 درجة مئوية) مع الدوران (15-30 دورة في الدقيقة). اغسل الخرزات مرتين (2x) باستخدام المخزن المؤقت للفحص / الغسيل (PBS-TBN: 1x PBS ، درجة الحموضة 7.4 + 0.1٪ BSA + 0.05٪ Tween-20 + 0.05٪ NaN315).ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات المنشطة في فاصل مغناطيسي لمدة 1-2 دقيقة. نضح المادة الطافية باستخدام ماصة من الخرز المثبت بالمغناطيس أو المحبب مع الأنبوب الذي لا يزال موضوعا في الفاصل المغناطيسي. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الدقيق من المغناطيس ، وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتنشيط. دوامة أنبوب التفاعل بلطف لتفريق الخرز. كرر الخطوات 2.8.1-2.8.4 مرة إضافية واحدة ليصبح المجموع غسلتين. في نهاية الغسيل ، سيتم تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من مخزن التنشيط بتركيز 10 × 106 حبات / مل.ملاحظة: يمكن عمل المخزن المؤقت للفحص / الغسيل بدون أزيد الصوديوم (مادة حافظة) إذا لم يتم استخدام المخزن المؤقت أيضا كوسيط تخزين. قم بتخزين حبات rhPD-1 المقترنة في الظلام في الثلاجة على حرارة 2-8 درجة مئوية إذا لم يتم استخدامها على الفور. الخرزات المقترنة بالبروتين مستقرة لمدة تصل إلى 18 شهرا. 3. تقييم اقتران rhPD-1 الناجح بالخرز ملاحظة: تتفاعل الكرات المجهرية المقترنة ب rhPD-1 مع rhPD-L1 البيوتينيل ، ويتم اكتشاف الأخير عن طريق الحضانة باستخدام SAPE متبوعا بتقييم على مقياس التدفق الخلوي. هذا يتحقق من كل من اقتران PD-1 الناجح بالخرز المغناطيسي وكذلك التفاعل الوظيفي بين بروتينات rhPD-1 و rhPD-L1. قم بإنشاء سلسلة تخفيف تسلسلي ذات شقين من rhPD-L1 البيوتينيل في PBS-TBN (محلول المخزون rhPD-L1 هو 1 مجم / مل). نطاق تركيز rhPD-L1 النهائي الذي سيتم اختباره هو محلول 8 ميكروغرام / مل وصولا إلى محلول 313 بيكوغرام / مل. قم بإنشاء أحجام 150 ميكرولتر من كل تخفيف rhPD-L1: 50 ميكرولتر لكل تفاعل وتفاعلين لكل حالة ، بالإضافة إلى فائض كاف لاستيعاب خسائر الماصة.قم بتسمية أنابيب الميكروفوج المخففة rhPD-L1 على أنها 8 ميكروغرام / مل ، 4 ميكروغرام / مل ، 2 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 0.25 ميكروغرام / مل ، 0.125 ميكروغرام / مل ، 0.063 ميكروغرام / مل ، و 0.031 ميكروغرام / مل. يعمل أنبوب 0 ميكروغرام / مل (PBS-TBN فقط) كعنصر تحكم no-PD-L1. قم بالتحميل المسبق 150 ميكرولتر من PBS-TBN لجميع أنابيب التخفيف rhPD-L1 الملصقة.ملاحظة: أعلى تركيز نهائي ل rhPD-L1 يتم اختباره هو 8 ميكروغرام / مل ، وسيتم تخفيف rhPD-L1 بنسبة 1: 1 عند إضافته إلى خليط التفاعل ، لذلك يشير أنبوب التخفيف المسمى “8 ميكروغرام / مل” إلى التركيز النهائي ويحتوي بالفعل على 16 ميكروغرام / مل rhPD-L1. تشير الملصقات الموجودة على جميع أنابيب التخفيف إلى تركيز rhPD-L1 النهائي بعد الإضافة إلى التفاعل. قم بإنشاء تخفيف rhPD-L1 الأعلى تركيزا (16 ميكروغرام / مل فعلي). هذا تخفيف من خطوتين ، 62.5 ضعفا لمحلول مخزون 1 مجم / مل rhPD-L1 (1,000 ميكروغرام / 16 ميكروغرام = 62.5).اجمع بين 84 ميكرولتر من PBS-TBN مع 16 ميكرولتر من محلول مخزون rhPD-L1 (1 مجم / مل ، أي 1000 ميكرولتر) في أنبوب طرد مركزي دقيق. هذا تخفيف 6.25 أضعاف ، والتركيز الناتج هو 160 ميكروغرام / مل rhPD-L1. في الأنبوب المسمى “8 ميكروغرام / مل” ، اجمع 270 ميكرولتر من PBS-TBN مع 30 ميكرولتر من تخفيف rhPD-L1 الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة (160 ميكروغرام / مل). هذا تخفيف بمقدار 10 أضعاف ، والتركيز الناتج هو في الواقع 16 ميكروغرام / مل. يشير ملصق الأنبوب “8 ميكروغرام / مل” إلى تركيزه النهائي بعد الإضافة إلى التفاعل. انقل 150 ميكرولتر من تخفيف rhPD-L1 الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.1.3 (“8 ميكروغرام / مل”) إلى أنبوب “4 ميكروغرام / مل” ، وأغلق غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، ودوامة لفترة وجيزة لخلط المحلول. كرر الخطوة 3.1.4 بالتتابع حتى تكتمل سلسلة التخفيف rhPD-L1. بعد الإنشاء ، يجب أن تحتوي جميع الأنابيب بين “8 ميكروغرام / مل” إلى “0.063 ميكروغرام / مل” ، وكذلك التحكم 0 ميكروغرام / مل ، على 150 ميكرولتر من المحلول ، ويجب أن يحتوي الأنبوب الأخير ، “0.031 ميكروغرام / مل” ، على 300 ميكرولتر من المحلول. هذا يخلق حجما كافيا من كل تخفيف لاختبار 50 ميكرولتر من كل تخفيف rhPD-L1 بيوتينيل في تفاعلات مكررة ، مع وجود فائض كاف متبقي لاستيعاب خسائر الماصة. عد حبات rhPD-1 المقترنة باستخدام مقياس الدم17. خفف خرزات المخزون rhPD-1 المقترنة إلى 5 × 104 حبات / مل ، بحجم كاف ل 2500 حبة / 50 ميكرولتر / تفاعل. دوامة 5 × 104 حبات / مل تعليق حبة مقترنة rhPD-1 ، وماصة 50 ميكرولتر من التعليق في كل بئر مسمى / معين للوحة عيار دقيق مستديرة القاع ذات 96 بئرا بحيث تكون هناك آبار مكررة تم إنشاؤها لكل تخفيف rhPD-L1 يتم اختباره. أضف 50 ميكرولتر من كل أنبوب تخفيف rhPD-L1 بيوتينيل تم إنشاؤه في الخطوة 3.1 إلى الآبار المناسبة على لوحة المعايرة الدقيقة. قم بتغطية لوحة المعايرة الدقيقة بورق معدني يمكن التخلص منه أو سدادة لاصقة بلاستيكية ، واحتضن اللوحة لمدة 1 ساعة في الظلام عند RT (18-22 درجة مئوية) على شاكر مداري (600 دورة في الدقيقة). اغسل البيوتينيل الزائد rhPD-L1 من الخرز.انقل اللوحة المختومة من شاكر المداري إلى فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة 2 دقيقة لشل حركة الخرز. قم بإزالة مانع تسرب الألواح اللاصقة بعناية ، وتأكد من أن المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة معا بإحكام ، واقلب اللوحة وتفريغ المواد الطافية في حوض أو حاوية نفايات سائلة بيولوجية ، حسب الاقتضاء. اضغط برفق ولكن بخفة على اللوحة المقلوبة على وسادة من المناديل الورقية الماصة لإزالة المادة الطافية المتبقية. قم بإزالة لوحة المعايرة الدقيقة من فاصل اللوحة المغناطيسية ، وماصة 150 ميكرولتر من PBS-TBN في كل بئر. ضع اللوحة غير المختومة على الفاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لشل حركة الخرز. تأكد من أن المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة معا بشكل آمن ، واقلب اللوحة وأفرغ المواد الطافية في حوض أو حاوية نفايات سائلة خطرة بيولوجيا ، حسب الاقتضاء. اضغط برفق ولكن بخفة على اللوحة المقلوبة على وسادة من المناديل الورقية الماصة لإزالة المادة الطافية المتبقية. كرر خطوات غسل اللوحة 3.7.3-3.7.5 مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات مع 150 ميكرولتر من PBS-TBN لكل منها. تأكد من عدم بقاء أي مادة طافية في الآبار في نهاية خطوة الغسيل الأخيرة. اعمل بثبات لمنع جفاف الخرز المتجمد على قيعان البئر. إضافة كاشف الكشف عن SAPE.قم بتخفيف محلول مخزون SAPE في PBS-TBN إلى تركيز عمل يبلغ 6 ميكروغرام / مل. قم بإعداد حجم كاف لمحلول عمل SAPE بحيث يمكن لجميع آبار التفاعل أن تتلقى 100 ميكرولتر / بئر ، مع كمية إضافية كافية لاستيعاب خسائر الماصة. قم بإزالة لوحة المعايرة الدقيقة من فاصل اللوحة المغناطيسية. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل SAPE في كل بئر تفاعل ، وأعد تعليق الخرزات المغسولة عن طريق الماصة. قم بإغلاق صفيحة العيار الدقيقة المكونة من 96 بئرا باستخدام سدادة من رقائق معدنية أو لوحة لاصقة بلاستيكية ، واحتضانها لمدة 1 ساعة في الظلام عند RT (18-22 درجة مئوية) على شاكر مداري عند 600 دورة في الدقيقة. قم بإزالة لوحة المعايرة الدقيقة من الحاضنة ، وانقلها إلى فاصل اللوحة المغناطيسية لشل حركة الخرز ، وإزالة مانع تسرب الألواح اللاصقة ، وغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 150 ميكرولتر PBS-TBN ، كما هو موضح في الخطوات 3.7.3-3.7.5. بعد إزالة الغسيل النهائي ، قم بإزالة اللوحة من فاصل اللوحة المغناطيسية ، وأعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من PBS-TBN لكل بئر. تحليل النتائج.اقرأ اللوحة الموجودة على أداة تحليل التدفق (انظر جدول المواد) لتحديد متوسط شدة التألق (MFI) لكل تفاعل باستخدام إعدادات الأداة التالية: حجم الشفط = 50 ميكرولتر ؛ الحد الأدنى لعدد الخرزات = 100 حبة ؛ إعداد المهلة = 40 ثانية ؛ البوابات = 7000-17000 ؛ وضع التشغيل = مراسل واحد. يتم تشغيل الآبار المكررة لكل حالة ، ويتم حساب متوسط قيمتي MFI الناتجتين لكل شرط قبل إجراء المزيد من حساب البيانات والرسوم البيانية.ملاحظة: يجب أن تظهر قيمة MFI لكل تخفيف ارتباطا يعتمد على التركيز ، مما يشير إلى كفاءة اقتران rhPD-1 المقبولة للخرزات وتأكيد التفاعل الجيد لبروتينات PD-1 / PD-L1 المؤتلفة. 4. PD-L1 مقايسة حجب PD-1 / PD-L1 القائمة على الخرزة المغناطيسية ملاحظة: يقيم هذا الفحص نشاط الحجب للوسطاء القابل للذوبان (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة للببتيد المضادة ل PDL1) على تفاعلات PD1 / PD-L1 المؤتلفة. باختصار ، يتم تحضين rhPD-L1 البيوتينيل مسبقا بالأجسام المضادة المتولدة في الأرانب بعد تلقيح الببتيد PDL1-Vaxx المختلفة. ثم يتم التقاط خليط الأجسام المضادة rhPD-L1 + anti-PDL1 باستخدام حبات مغناطيسية مقترنة ب rhPD-1 ، ويتم تحديد ارتباط rhPD-L1 بالخرز المقترن rhPD-1 بإضافة ستربتافيدين PE. ترتبط إشارة مضان PE عكسيا بنشاط الحجب للأجسام المضادة / مثبطات PDL1 المختبرة. يتم تقييم ارتباط الأجسام المضادة للببتيد المضاد ل PDL1 في وقت واحد من خلال ربط الأجسام المضادة للأرانب المقترنة ب BV421 (للأجسام المضادة للببتيد المضادة ل PDL1) أو الجسم المضاد للإنسان (للتحكم في الأجسام المضادة) ومن خلال تقييم مضان BV421 في القناة الثانية للأداة. خطوات الفحص مفصلة تصويريا في الشكل 1. قم بإعداد سلسلة تخفيف تسلسلية ذات شقين للأجسام المضادة للاختبار ، بما في ذلك الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي يسببها PDL1-Vaxx ، والجسم المضاد للتحكم السلبي (تراستوزوماب ، هيرسيبتين ، الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل HER2) ، والجسم المضاد للتحكم الإيجابي (أتيزوليزوماب ؛ جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل PDL1 IgG1). سيستخدم كل تفاعل 25 ميكرولتر من تخفيف الجسم المضاد المخصص ، وبالتالي فإن الأحجام الموضحة كافية لأداء كل تفاعل في آبار مكررة لكل حالة (أي 50 ميكرولتر لكل حالة) ، مع بعض الفائض المتبقي لاستيعاب خسائر الماصة.لكل جسم مضاد للببتيد PDL1 مستحث باللقاح وجسم مضاد للتحكم ، تأكد من أن نطاق تركيزات الأجسام المضادة النهائية التي تم اختبارها يتراوح من 1000 ميكروغرام / مل إلى 8 ميكروغرام / مل. تحضير محاليل مخزون لجميع الأجسام المضادة عند 2000 ميكروغرام / مل. لكل جسم مضاد ، قم بتسمية أنابيب التخفيف على أنها 1,000 ميكروغرام / مل ، 500 ميكروغرام / مل ، 250 ميكروغرام / مل ، 125 ميكروغرام / مل ، 63 ميكروغرام / مل ، 31 ميكروغرام / مل ، 16 ميكروغرام / مل ، و 8 ميكروغرام / مل ، وقم بتضمين اسم الجسم المضاد. لكل جسم مضاد ، أضف أيضا أنبوبا “0 ميكروغرام / مل” ، والذي سيكون عنصر التحكم في السيارة فقط (PBS-TBN).ملاحظة: عند إضافته إلى خليط التفاعل ، سيتم تخفيف تركيز الجسم المضاد بنسبة 1: 1. يشار إلى أنابيب تخفيف الأجسام المضادة بأنها التركيز النهائي للجسم المضاد بعد إضافته إلى التفاعل، وتحتوي في الواقع على ضعف كمية الجسم المضاد المعروضة عليه. أضف 75 ميكرولتر من PBS-TBN إلى جميع أنابيب تخفيف الأجسام المضادة المسماة “500 ميكروغرام / مل” وأدناه ، بما في ذلك أنابيب التحكم “0 ميكروغرام / مل” للمركبة فقط. لكل جسم مضاد ، ماصة 150 ميكرولتر من محلول المخزون 2000 ميكروغرام / مل في الأنبوب المعني المسمى “1000 ميكروغرام / مل”. سيتم استخدام هذا لعمل جميع التخفيفات اللاحقة لكل جسم مضاد. لكل جسم مضاد ، قم بإنشاء سلسلة تخفيف كاملة عن طريق نقل الماصة 75 ميكرولتر من أنبوب “1000 ميكروغرام / مل” إلى الأنبوب مع التخفيف السفلي التالي في السلسلة (أي “500 ميكروغرام / مل”). أغلق أنبوب التخفيف المكتمل حديثا ، وقم بتدويره لفترة وجيزة ، واستمر في بناء سلسلة التخفيف عن طريق نقل 75 ميكرولتر من أنبوب “500 ميكروغرام / مل” إلى أنبوب “250 ميكروغرام / مل”. كرر هذا النمط حتى يتم إجراء التخفيف الأخير ، “8 ميكروغرام / مل” ، لجميع الأجسام المضادة.ملاحظة: في سلسلة التخفيف المكتملة لكل جسم مضاد ، يجب أن يكون هناك حجم 75 ميكرولتر لجميع الأنابيب باستثناء أقل تخفيف ، 8 ميكروغرام / مل ، والذي يجب أن يحتوي على حجم 150 ميكرولتر. سيستخدم كل تفاعل 25 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة ، لذا فإن هذه الأحجام كافية لأداء كل تفاعل في آبار مكررة لكل حالة (أي 50 ميكرولتر لكل حالة) ، مع إضافة لاستيعاب خسائر الماصة. ضع 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة في الآبار المخصصة للوحة عيار 96 بئرا. تمييع البيوتينيل rhPD-L1 إلى تركيز عمل قدره 4 ميكروغرام / مل في PBS-TBN بحجم كاف ليشمل 25 ميكرولتر في الآبار المكررة لكل حالة (أي 50 ميكرولتر لكل حالة) ، مع إضافة لاستيعاب خسائر الماصة.ملاحظة: في هذا العمل ، أدى rhPD-L1 البيوتينيل عند 4 ميكروغرام / مل إلى حوالي 50٪ من الحد الأقصى لإشارة MFI المقاسة في تقييم الاقتران السابق وتم استخدامه لتحليل حصار PD-1 / PD-L1. أضف 25 ميكرولتر من rhPD-L1 البيوتينيل (4 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر تفاعل ، وقم بتغطية لوحة المعايرة الدقيقة بختم لاصق أو بلاستيكي ، واحتضانها عند RT (18-22 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة مع الاهتزاز على شاكر اللوحة المدارية عند 600 دورة في الدقيقة. قم بتخفيف الخرزات المقترنة ب rhPD-1 إلى 50000 حبة / مل ، مع حجم كاف ل 50 ميكرولتر / بئر (2500 حبة / بئر) بالإضافة إلى المزيد لاستيعاب خسائر الماصة. قم بإزالة لوحة تفاعل المعايرة الدقيقة ذات 96 بئرا من شاكر ، وقم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة. أضف 50 ميكرولتر من خليط حبة rhPD-1 المقترنة إلى كل بئر. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في الظلام عند RT (18-22 درجة مئوية) على شاكر مداري عند 600 دورة في الدقيقة. انقل اللوحة المختومة من شاكر المداري إلى فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة 2 دقيقة لشل حركة الخرز. قم بإزالة مانع تسرب الألواح اللاصقة بعناية ، وتأكد من أن المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة معا بإحكام ، وقم بعكس اللوحة وتفريغ المواد الطافية. اضغط برفق على اللوحة المقلوبة على وسادة من المناديل الورقية الماصة لإزالة المادة الطافية الزائدة. اغسل كواشف التفاعل الزائدة من الخرز.قم بإزالة لوحة المعايرة الدقيقة من فاصل اللوحة المغناطيسية ، وأضف 150 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر. ضع لوحة المعايرة الدقيقة على فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة 2 دقيقة لشل حركة الخرز. تأكد من أن المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة معا بشكل آمن ، واقلب اللوحة وتخلص من المواد الطافية. اضغط برفق على اللوحة المقلوبة على وسادة من المناديل الورقية الماصة لإزالة المادة الطافية الزائدة. كرر خطوات غسل اللوحة 4.11.1-4.11.3 مرتين ، ليصبح المجموع ثلاث غسلات باستخدام PBS-TBN. تأكد من تحضير كاشف SAPE (أدناه) قبل إزالة محلول الغسيل النهائي (الثالث). أضف كاشف الكشف SAPE.تمييع محلول مخزون SAPE إلى تركيز عمل 6 ميكروغرام / مل في PBS-TBN ؛ اصنع حجما كافيا ل 100 ميكرولتر / بئر ، بالإضافة إلى حجم إضافي لاستيعاب خسائر الماصة. أضف 100 ميكرولتر / بئر من محلول عمل SAPE في كل بئر تفاعل ، وأعد تعليق الخرز عن طريق الماصة. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في الظلام عند RT (18-22 درجة مئوية) على شاكر مداري عند 600 دورة في الدقيقة. صب SAPE الزائد من رد الفعل.انقل اللوحة المختومة من شاكر المداري إلى فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة 2 دقيقة لشل حركة الخرز. قم بإزالة مانع تسرب الألواح اللاصقة بعناية ، وتأكد من أن المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة معا بإحكام ، واقلب اللوحة وتفريغ المادة الطافية. اضغط برفق على اللوحة المقلوبة على وسادة من المناديل الورقية الماصة لإزالة المادة الطافية التي تحتوي على SAPE الزائد. اغسل SAPE الزائد من الخرز.قم بإزالة لوحة المعايرة الدقيقة من حامل اللوحة المغناطيسية. أضف 150 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر لإعادة تعليق الخرزات. ضع لوحة المعايرة الدقيقة على فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة 2 دقيقة لشل حركة الخرز. تأكد من أن المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة معا بشكل آمن ، واقلب اللوحة وتفريغ المادة الطافية. اضغط برفق على اللوحة المقلوبة على وسادة من المناديل الورقية الماصة لإزالة المادة الطافية الزائدة. قم بإجراء خطوتين إضافيتين للغسيل باستخدام PBS-TBN لما مجموعه ثلاث غسلات بتكرار الخطوات 4.15.1-4.15.4. جهز الأجسام المضادة للكشف الثانوي BV421 (الخطوة التالية) قبل إزالة محلول الغسيل النهائي (الثالث). أضف الأجسام المضادة الثانوية المجمعة BV421.تمييع BV421-congugated anti-human IgG (للكشف عن الأجسام المضادة للتحكم الإنساني) و BV421-congugated anti-rabbit IgG (للكشف عن الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي يسببها PDL1-Vaxx) (انظر جدول المواد) 1: 400 في Wash / Assay Buffer بأحجام كافية لاستخدام 100 ميكرولتر / بئر لكل منها ، مع إضافة لاستيعاب خسائر الماصة. أضف 100 ميكرولتر من IgG المخفف المضاد للإنسان BV421 أو BV421 المترافق المضاد للأرانب IgG إلى الآبار المناسبة. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في الظلام عند RT (18-22 درجة مئوية) على شاكر مداري عند 600 دورة في الدقيقة. صب الأجسام المضادة الثانوية المترافقة BV421 الزائدة من الخرزات.انقل اللوحة المختومة من شاكر المداري إلى فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة 2 دقيقة لشل حركة الخرز. قم بإزالة مانع تسرب الألواح اللاصقة بعناية ، وتأكد من أن المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة معا بإحكام ، واقلب اللوحة وتفريغ المادة الطافية. اضغط برفق على اللوحة المقلوبة على وسادة من الأنسجة الورقية الماصة لإزالة المادة الطافية التي تحتوي على أجسام مضادة ثانوية مقترنة ب BV421. اغسل الأجسام المضادة الثانوية المترافقة BV421 الزائدة من الخرز.أضف 150 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر لإعادة تعليق الخرزات. ضع لوحة المعايرة الدقيقة على فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة 2 دقيقة لشل حركة الخرز. تأكد من أن المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة معا بشكل آمن ، واقلب اللوحة وتفريغ المادة الطافية. اضغط برفق على اللوحة المقلوبة على وسادة من المناديل الورقية الماصة لإزالة المادة الطافية الزائدة. قم بإجراء ثلاث خطوات غسيل إضافية باستخدام PBS-TBN لما مجموعه أربع غسلات بتكرار الخطوات 4.19.1-4.19.3. بعد إزالة المخزن المؤقت الأخير (الرابع) للغسيل ، قم بإزالة لوحة المعايرة الدقيقة من فاصل اللوحة المغناطيسية ، وأعد تعليق الخرز في 100 ميكرولتر PBS-TBN / بئر باستخدام ماصة. تحليل النتائج.اقرأ اللوحة الموجودة على نظام تحليل التدفق ثنائي المراسل لتحديد MFI لكل تفاعل باستخدام إعدادات الأداة التالية: حجم الشفط = 50 ميكرولتر ؛ الحد الأدنى لعدد الخرزات = 100 حبة ؛ إعداد المهلة = 40 ثانية ؛ البوابات: 7000-17000 ؛ وضع التشغيل = مراسل مزدوج. مع نظام المراسل المزدوج ، تأكد من أن قناة Reporter 1 تقيس مضان PE البرتقالي (كمية rhPD-L1 المرفقة بالخرز المترافق rhPD-1) وتقيس قناة Reporter 2 مضان BV421 الأزرق (كمية الجسم المضاد المانع المرفق المرتبط ب rhPD-L1). قم بتشغيل الآبار المكررة لكل حالة ، وقم بحساب متوسط قيمتي MFI الناتجتين لكل شرط قبل إجراء المزيد من حساب البيانات والرسوم البيانية. توحيد قيمة MFI لكل عينة إلى التحكم السلبي ، وحساب النسبة المئوية للتثبيط لكل عينة:تثبيط٪ = (100 × [MFI للتحكم السلبي – عينة MFI]) / MFI للتحكم السلبيملاحظة: قيم MFI للتحكم السلبي (بدون تثبيط) هي أعلى القيم ؛ إشارة PD-L1 المرتبطة MFI هي 100٪ ، ويتم تعريف تثبيط ارتباط rhPD-L1 ب rhPD-1 على أنه 0٪. الشكل 1: رسم تخطيطي لمقايسة الحصار PD-1 / PD-L1 للمراسل المزدوج. يتم تحضين PD-L1 البشري المؤتلف البيوتينيل (rhPD-L1) مسبقا بأجسام مضادة PDL1 مختارة مستحثة بواسطة PDL1-Vaxx قبل دمجها مع حبات مغناطيسية مقترنة ب rhPD-1 للسماح بتكوين معقد نقطة تفتيش PD-1 / PD-L1. ثم يتم الكشف عن rhPD-L1 المعقد وتمييزه بإضافة phycoerythrin المقترن بالستربتافيدين (SAPE ، الفلوروفور البرتقالي). تستهدف الأجسام المضادة ضد حوائط PDL1-Vaxx rhPD-L1 التي تعقدت إلى rhPD-1 مقترنة مسبقا بالخرز المغناطيسي ، ويتم إضاءتها باستخدام جسم مضاد ثانوي مقترن باللون البنفسجي اللامع 421 (BV421 ، فلوروفور أزرق). يتم تحليل كل من rhPD-L1 البيوتينيل المعقد إلى PD-1 (إشارة PE) والأجسام المضادة المضادة ل PDL1 التي تتعرف على إشارة rhPD-L1 (إشارة BV421) وتربطها بشكل متزامن باستخدام أداة قياس خلوي للتدفق المزدوج للمراسل تستجوب عينات لكل من الفلوروفورات في قناتين منفصلتين للمراسلين. قيم المخرجات لكل عينة هي متوسط شدة التألق لكل فلوروفور. ثم يتم استقراء تثبيط تكوين معقد PD1 / PD-L1 بواسطة أجسام مضادة مختلفة مستحثة ب PDL1-Vaxx من خلال مقارنة الإشارات التجريبية بتلك التي تم إنشاؤها باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للتحكم السلبي لا يربط rhPD-L1 (تثبيط 0٪). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
كان الفحص قادرا على التحديد الكمي الدقيق لتثبيط تفاعل PD-1 / PD-L1 بواسطة أربعة أجسام مضادة متعددة النسيلة فريدة من نوعها ، تم إنشاؤها ضد ببتيدات لقاح rhPD-L1 ، والتي يتم استكشافها كعوامل علاجية محتملة للسرطان. يتم توفير مخطط لهذا الفحص في الشكل 1. تم قياس كمية البيوتينيل rhPD-L1 المرتبطة بالخرز المترافق rhPD-1 وتثبيط هذا الارتباط بواسطة الأجسام المضادة الأربعة المرشحة للأجسام المضادة التي يسببها PLD1-Vaxx في قناة Reporter 1 باستخدام كاشف الكشف عن streptavidin-PE الذي يربط مباشرة rhPD-L1 (الشكل 2). منعت جميع الأجسام المضادة الأربعة متعددة النسيلة المضادة ل PDL1-peptide تفاعل rhPD-L1 مع PD-1 الذي تم تجميده على الكرات المجهرية بدرجات متفاوتة. تراوحت النسبة المئوية لتثبيط الأجسام المضادة المختلفة للببتيد المضاد ل PDL1 من 48٪ إلى 74٪ عند أقصى تركيز تم اختباره وهو 1000 ميكروغرام / مل. حقق الجسم المضاد أحادي النسيلة ذو التحكم الإيجابي أتيزوليزوماب حصارا بنسبة 92٪ لتفاعل PD-1 / PD-L1 عند أقصى تركيز تم اختباره14 من 4 ميكروغرام / مل (الشكل 2). أظهرت جميع الأجسام المضادة التجريبية PDL1-Vaxx تثبيطا يعتمد على التركيز لارتباط rhPD-L1 بالخرز المترافق rhPD-1 مقارنة مع تراستوزوماب ، الجسم المضاد للتحكم السلبي الذي لم يكن من المتوقع أن يتفاعل مع نظام PD-1 / PD-L1. الشكل 2: حصار تفاعل rhPD-L1 مع rhPD-1 مقترنا بالخرز المغناطيسي بواسطة الأجسام المضادة للببتيد PDL1 ، كما هو موضح في اختبار مناعي جديد قائم على حبة الفلورسنت. اقترن PD-1 البشري المؤتلف بالكريات المجهرية المغناطيسية ، ثم تم تحضين الخرزات ب rhPD-L1 البيوتينيل الذي تم تحضينه مسبقا بأجسام مضادة مختلفة مضادة للببتيد PDL1. تم استخدام كاشف الكشف عن الستربتافيدين – فيكوريثرين لربط البيوتين ، وبالتالي تقييم الكمية النسبية من rhPD-L1 التي كانت متاحة للارتباط ب PD-1. تم اختبار الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي أثيرت في الأرانب ضد لقاحات الببتيد PDL1 (مضاد PDL1 [36] ، مضاد PDL1 [50] ، مضاد PDL1 [95] ، ومضاد PDL1 [130]) للنشاط المثبط وأظهر حصارا بنسبة 48٪ -74٪ لتفاعلات PD-1 / PD-L1 المؤتلفة عند أعلى تركيز تم اختباره. تم استخدام Atezolizumab (جسم مضاد أحادي النسيلة مختلف مضاد ل PDL1) كعنصر تحكم إيجابي. تم استخدام تراستوزوماب الأجسام المضادة أحادية النسيلة التجارية غير ذات الصلة (anti-HER2) كعنصر تحكم سلبي. هذا الرقم مقتبس من Guo et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: الارتباط المقارن لمختلف الأجسام المضادة التي يسببها PDL1-Vaxx إلى rhPD-L1 المعقدة إلى الخرز المغناطيسي المغلف ب rhPD1. تم استخدام الجسم المضاد للكشف الثانوي البنفسجي اللامع 421 مترافقا لمقارنة ارتباط الأجسام المضادة المختلفة متعددة النسيلة المضادة للببتيد PDL1 ب rhPD-L1 عبر حبات rhPD-1 المغلفة. تم تسجيل إشارة التألق الأزرق BV421 في قناة المراسل 2 لأداة المراسل المزدوج. ترتبط هذه الإشارة بكفاءة الربط النسبية للأجسام المضادة التجريبية المضادة للببتيد PDL1. تم استخدام Trastezumab (مضاد HER2) ، وهو جسم مضاد وحيد النسيلة يستهدف نقطة تفتيش مختلفة عن PD-1 / PD-L1 ، كعنصر تحكم سلبي. يمثل MFI متوسط شدة مضان الخرز المتوسط ، والذي تم قياسه في آبار التفاعل المكررة لكل حالة. هذا الرقم مقتبس من Guo et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تمت مقارنة القدرات النسبية للأجسام المضادة المرشحة التجريبية الأربعة التي يسببها PDL1-Vaxx لربط rhPD-L1 باستخدام نظام كشف منفصل (BV421-conjugated anti-rabbit IgG) الذي تم تقييمه على قناة المراسل الثانية للأداة. أشارت هذه النتائج إلى أن جميع الأجسام المضادة الأربعة متعددة النسيلة المضادة لببتيد PDL1 مرتبطة ب rhPD-L1 بطريقة تعتمد على التركيز14 (الشكل 3). أظهر الجسم المضاد ل PDL1 (130) أعلى إشارة ربط rhPDL1 من أربعة مرشحين للأجسام المضادة التي يسببها PDL1-Vaxx.
Discussion
الغرض من العلاج المناعي للسرطان المرتبط بنقاط التفتيش هو تعطيل التفاعل بين بروتينات نقاط التفتيش وروابطها المهمة في بقاء الورم وتطوره2. تعمل هذه المجموعة البحثية بنشاط على تطوير لقاحات جديدة PD-1 و PD-L1 تثير استجابة الأجسام المضادة التي تستهدف وتقطع نقطة تفتيش PD-1 / PD-L13،8،13،14. في السابق ، تم إجراء نوعين مختلفين من مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) لتقييم آثار الأجسام المضادة للببتيد المضاد ل PDL1 على تثبيط تفاعل PD1 / PD-L1 المؤتلف14. (1) في البديل الأول ، تم طلاء rhPD-L1 على صفيحة عيار ميكروي ، ثم تم تحضين الصفيحة بأجسام مضادة مخففة للقاح PDL1. ثم تم تقييم تثبيط تفاعل PD-1 / PD-L1 المؤتلف بواسطة الأجسام المضادة عن طريق إضافة rhPD-1 البيوتينيل وتحديد الارتباط ب rhPD-L1 المتجمد باستخدام اقتران البيروكسيديز الستربتافيدين والفجل والركيزة اللونية. عرفنا هذا على أنه فحص الحصار المباشر. (2) في البديل الثاني ، تم طلاء PD-1 على لوحة المعايرة الدقيقة. تم تحضين rhPD-L1 البيوتينيل مسبقا مع كل من الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي يسببها المرشح المضاد ل PLD1 في أنابيب تفاعل منفصلة. ثم تمت إضافة مخاليط rhPDL1 / anti-PDL1 إلى آبار الألواح التي تحتوي على rhPD-1 المتجمد وسمح لها بالتفاعل. تم الكشف عن أي rhPDL1 الذي تفاعل مع rhPD-1 المتجمد في وجود الأجسام المضادة التي يحتمل أن تكون حاصرة PDL1-Vaxx مع streptavidin-HRP اللاحق وحضانة الركيزة اللونية. عرفنا هذا على أنه مقايسة الحصار العكسي.
أظهر الحصار العكسي لتفاعل PD-1 / PD-L1 المؤتلف بواسطة الأجسام المضادة للببتيد PDL1 تثبيطا للإشارة (أي حصار PD-1 / PD-L1) بطريقة تعتمد على تركيز الأجسامالمضادة 14 ، في حين أن نهج الحصار المباشر لم يقدم نتائج متسقة (غير معروضة). تم تطوير مقايسة الحصار المزدوج القائم على الخرزة للتحقق من نتائج ELISA والتحقيق في حصار تفاعل PD-1 / PD-L1 في مرحلة السوائل ، مما يلغي مشاكل توفر العوائق / الارتباط المحتملة المرتبطة بشل حركة البروتينات المؤتلفة على قيعان الآبار. ارتبط تحليل الكرة المجهرية ارتباطا مباشرا بنتائج حجب ELISA باستخدام مقايسة الحصار العكسي (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر المقايسات المناعية القائمة على التألق حساسية محسنة للمقايسة ونطاقا ديناميكيا موسعا مقارنة ب ELISAs18 اللوني ، علاوة على ذلك ، يسمح الفحص القائم على الخرزة المتعددة بالأداء المتزامن لمقايستين مناعيتين مستقلتين ضمن تفاعل واحد. ربما أدى السلفو-NHS و EDC المستخدم في الاقتران التساهمي للكرات المجهرية إلى rhPD-1 إلى اختلافات الأداء التي لوحظت بين مقايسات الحصار المباشر والحصار العكسي والاختلافات الملحوظة في الحساسية بين مقايسات تفاعل PD-1 / PD-L1 المؤتلفة القائمة على حبة ELISA و Luminex. هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحقيقات على المستوى الكيميائي والجزيئي لدراسة الآليات المحتملة المسؤولة عن هذه الاختلافات.
يوضح كل من ELISA14 والمقايسات القائمة على الخرزة أن الأجسام المضادة المضادة ل PDL1 التي يسببها PDL1-Vaxx يمكن أن تمنع تكوين معقد نقطة تفتيش PD1 / PD-L1. يحفز PDL1-Vaxx القائم على الببتيد بنجاح الأجسام المضادة المضادة ل PDL1 التي يمكن أن تمنع تفاعل PD-1 / PD-L1. قد يكون هذا النهج بمثابة استراتيجية علاجية جديدة لعلاج السرطان ، كما تدعمها الدراسات الحيوانية قبل السريرية3،13،14. ستحدد التجارب السريرية المخطط لها فعالية PDL1-Vaxx للعلاج المناعي لنقاط التفتيش والسيطرة على الأمراض لدى مرضى السرطان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون شيري دنبار دكتوراه ، ماجستير في إدارة الأعمال من شركة Luminex Corporation (أوستن ، تكساس) لدعم البحث وماثيو سيلفرمان دكتوراه في حلول النشر الطبي الحيوي (بنما سيتي ، فلوريدا ؛ mattsilver@yahoo.com) للمساعدة العلمية والكتابية. تم دعم هذا العمل بجوائز ل Pravin T. P. Kaumaya من المعاهد الوطنية للصحة (R21 CA13508 و R01 CA84356) و Imugene Ltd ، سيدني ، أستراليا (OSU 900600 و GR110567 و GR124326).
Materials
| Buffers | |||
| Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 | Millipore/Sigma | S3139 | |
| Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) | Millipore/Sigma | P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide) | |
| Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 | MilliporeSigma | M2933 | |
| Coupling Reagents | |||
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 77149 | |
| xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: | Luminex Corp. (Austin, TX) | 40-50016 | |
| EDC, 10 mg | |||
| sNHS solution, 250 µL | |||
| Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0 | |||
| Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN) | |||
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 24510 | |
| Instrumentation and Ancillary Lab Supplies | |||
| xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) | Luminex Corp. (Austin, TX) | INTELLIFLEX-DRSE-RUO | |
| Low protein-binding round bottom 96-well plate | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 07-200-761 | |
| Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable) | Luminex Corp. (Austin, TX) | CN-0269-01 | |
| Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) | Luminex Corp. (Austin, TX) | CN-0288-01 | |
| MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) | Luminex Corp. (Austin, TX) | MC-1**** (varies by bead label) | |
| Protein LoBind microcentrifuge tubes | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 022431081 | |
| Peptides, Antibodies, & Detection Reagents | |||
| Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control | Genentech/Roche (San Francisco, CA) | n/a (prescription medications) | |
| Biotinylated recombinant human PDL1 | Sino Biological (Wayne, PA) | 10084-H49H-B | |
| Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) | 709-675-149 | |
| Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) | 711-675-152 | |
| Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) | Acro Biosystems (Newark, DE) | PD1-H5256 | |
| Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) | Agilent (Santa Clara, CA) | PJRS34-1 | |
| Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control | Genentech/Roche (San Francisco, CA) | n/a (prescription medications) |
References
- Kaumaya, P. T. B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine. Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).
- Pandey, P., et al. Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4. Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).
- Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys). Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).
- Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity. Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).
- Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).
- Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
- Kaumaya, P. T. A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).
- Guo, L., Kaumaya, P. T. P. First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations. British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).
- Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine. Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).
- Dakappagari, N. K., et al. Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).
- Kaumaya, P. T., et al. Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).
- Bekaii-Saab, T., et al. Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors. Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).
- Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model. Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).
- Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx). Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).
- . Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition Available from: https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F (2022)
- MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation Available from: https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview (2014)
- Green, M. R., Sambrook, J. . Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), (2019).
- Selecting the Detection System – Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf (2019)
Tags
Magnetic Fluorescent BeadsDual-reporter Flow AnalysisPDL1-Vaxx Peptide VaccinePD-1/PD-L1 InteractionAntibody BlockadeB-cell Epitope Peptide VaccinesImmune Checkpoint TargetsPD-L1 ProteinPD-1 LigandB-VaxxPD1-VaxxPDL1-VaxxCTLA4-VaxxCancer VaccinesHER2Immune Checkpoint MarkersCombination ImmunotherapiesTumor Growth InhibitionMetastasis PreventionPatient Survival
Cite This Article
Overholser, J., Guo, L., Kaumaya, P. T. P. Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction. J. Vis. Exp. (197), e65467, doi:10.3791/65467 (2023).