PD-1/PD-L1 Etkileşiminin PDL1-Vaxx Peptit Aşısı ile İndüklenen Antikor Blokajının Manyetik Floresan Boncuk Tabanlı Çift Raportörlü Akış Analizi

1. Deneysel hazırlık NOT: Bu adımda bahsedilen tüm reaktiflerin/ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Rekombinant insan PD-1 (rhPD-1; polihistidin etiketli) elde edin. Kullanmadan önce liyofilize rhPD1’i steril filtrelenmiş fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 ile sulandırın. Biyotinillenmiş rekombinant insan PD-L1 (rhPD-L1) elde edin. Kullanmadan önce liyofilize rhPD-L1’i steril deiyonize su ile sulandırın. Streptavidin konjuge R-fikoeritrin tespit reaktifi (SAPE) elde edin. Işıktan korunan tüm SAPE solüsyonlarını buzdolabı sıcaklıklarında (yani 2-8 °C) saklayın. Floresanla boyanmış manyetik mikro küreler (6.5 μm çapında, gömülü manyetitli polistiren) ve Boncuk Bağlantı Kiti15 (kullanılıyorsa, Malzeme Tablosuna bakın) elde edin. Mikrokürelere kovalent bağlanma, sülfo-NHS (sülfo-N-hidrosüksinimid) ve EDC (N-[3-dimetilaminopropil]-N’-etilkarbodiimid hidroklorür) gerektirir.NOT: Manyetik boncuk setleri, farklı boncuk setlerinden16 tanımlamaya ve ayırt etmeye izin veren 500 benzersiz floresan etiketten herhangi biriyle mevcuttur. Boncuklar, 2,5 × 106 boncuk/mL ve 12,5 × 106 boncuk/mL stok konsantrasyonlarında sunulmaktadır. Boncukları ışıktan koruyarak buzdolabı sıcaklıklarında (yani 2-8 °C) saklayın. Boncuk süspansiyonlarını dondurmayın. Pozitif ve negatif kontrol antikorları ve Brilliant Violet 421 (BV421) etiketli ikincil tespit antikorları elde edin. Tüm floresan konjuge molekülleri ışıktan koruyarak saklayın. Tüm bağlanma reaksiyonlarını düşük proteinli bağlanma tüplerinde ve tüm tahlil reaksiyonlarını düşük proteinli bağlanma, yuvarlak tabanlı, 96 oyuklu mikrotitre plakalarında gerçekleştirin. Tahlil inkübasyon adımları için plakaları tek kullanımlık yapışkan folyo veya plastik 96 oyuklu mikroplaka kapakları ile kapatın. Tahlil yıkama adımları sırasında boncukları hareketsiz hale getirmek için manyetik bir plaka ayırıcı kullanın.NOT: Çift raportörlü akış analiz sisteminin üç lazeri vardır: (1) boncuk setine özgü floresansı tanımlayan ve ölçen bir lazer (Sınıflandırma Kanalı); (2) hedefe özgü fikoeritrin (PE) floresansını tespit eden ve ölçen (Reporter Channel 1; 532 nm uyarma, “turuncu” 565-585 nm emisyon); ve (3) ikinci bir hedef analitin hedefe özgü BV421 floresansını tespit eden ve ölçen bir kanal (Reporter Channel 2; 405 nm uyarma, “mavi” 421-441 nm emisyon). 2. rhPD-1’in manyetik boncuklara bağlanması NOT: Bağlanacak protein, sığır serum albümini (BSA), sodyum azid, glisin, gliserol, tris (hidroksi-metil) aminometan (Tris) veya amin içeren katkı maddeleri içermemeli ve pH 7.4’te PBS’de süspanse edilmelidir. Burada açıklanan tüm gerekli reaktifleri ve tamponları içeren ticari bir bağlantı kiti mevcuttur (Malzeme Tablosuna bakın). Tüm kaplin reaktiflerini buzdolabından çıkarın ve 20-30 dakika oda sıcaklığına (RT, 18-22 °C) dengelenmelerini bekleyin. Ürün bilgi sayfasına göre kısa bir süre girdap, sonikasyon veya döndürme (15-30 rpm’de 15 dakika) yaparak stok mikrokürelerini yeniden askıya alın. 1 × 106 manyetik boncukları 1.5 mL düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Malzeme Tablosuna bakın). 100 μL Aktivasyon Tamponu15 ile boncukları yıkayın: 0.1 M NaH2PO4 (monobazik), pH 6.2.NOT: Birleştirme, alternatif bir aktivasyon ve birleştirme tamponu olarak 0.1 M 2-morfolinoetansülfonik asit (MES), pH 6.0 içeren önceden yapılandırılmış bir Birleştirme Kiti kullanılarak da gerçekleştirilebilir (Malzeme Tablosuna bakın).Boncukları içeren tüpü 1-2 dakika manyetik bir ayırıcıya yerleştirin.NOT: Alternatif olarak, boncuklar 1-2 dakika boyunca ≥8.000 × g’da mikrosantrifüjleme ile ayrılabilir. Süpernatanı, tüp hala manyetik ayırıcıya yerleştirilmişken, mıknatısla hareketsiz hale getirilmiş veya peletlenmiş boncuklardan bir pipetle aspire edin. Mikrosantrifüj tüpünü mıknatıstan çıkarın ve 80 μL Kaplin Tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Reaksiyon tüpünü nazikçe vorteksleyin ve boncukları dağıtmak için 20 saniye boyunca sonikasyon yapın. Boncukları sulfo-NHS ve EDC ile etkinleştirin.NOT: Sülfo-NHS’nin stok çözeltisi, Aktivasyon Tamponunda çözülmüş 50 mg / mL’dir. EDC’nin stok çözeltisi ayrıca Aktivasyon Tamponu içinde çözülmüş 50 mg / mL’dir. Hem Aktivasyon Tamponu hem de atmosferdeki nem EDC bozulmasına neden olur. Depolanmış EDC çözeltisinin kullanılması tavsiye edilmez. Adımdan önce yeterince taze EDC çözeltisi hazırlayın ve çözelti hazır olduğunda hemen kullanın. Fazla EDC çözeltisini atın.DİKKAT: EDC ciddi göz tahrişine neden olur ve solunum yollarını ve cildi tahriş eder.Yıkanmış ve aktive edilmiş boncukları içeren mikrofüj tüpüne 10 μL sülfo-NHS ekleyin. Boncukları ve sülfo-NHS’yi içeren mikrofüj tüpüne 10 μL EDC stok çözeltisi ekleyin. Işığa duyarlı mikrokürecikleri ışıktan koruyun ve döndürücü üzerinde RT’de (18-22 °C) 15-30 rpm’de 20 dakika döndürün. Alternatif olarak, boncukları 10 dakikalık aralıklarla yeniden dağıtmak için hafifçe girdaplanırsa, tüp aktivasyon adımı sırasında sabit kalabilir. Fazla bağlantı reaktiflerini boncuklardan yıkayın.Aktif boncukları içeren tüpü 1-2 dakika boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Süpernatanı, tüp hala manyetik ayırıcıda konumlanmışken, mıknatısla hareketsiz hale getirilmiş veya peletlenmiş boncuklardan bir pipetle aspire edin. Mikrosantrifüj tüpünü mıknatıstan çıkarın ve 100 μL Aktivasyon Tamponu ekleyin. Boncukları dağıtmak için reaksiyon tüpünü hafifçe döndürün. Toplam üç yıkama için 2.6.1-2.6.4 adımlarını iki kez daha tekrarlayın. Yıkama sonunda boncuklar, yaklaşık 10 ×10 6 boncuk/mL konsantrasyonda 100 μL Aktivasyon Tamponu içinde süspanse edilecektir. rhPD-1 peptidini aktive edilmiş boncuklara bağlayın.Toplam boncuk süspansiyon hacmini 490 μL’ye çıkarmak için aktif boncukları içeren tüpe 390 μL Aktivasyon Tamponu ekleyin. Aktive edilmiş boncukları içeren tüpe 10 μL PD-1 peptit çözeltisi (PBS içinde çözülmüş 1 mg / mL) ekleyerek aktive edilmiş boncuk süspansiyonuna 1 μg PD-1 peptid ekleyin. PD-1 ve aktif boncukları eşit olarak dağıtmak için mikrosantrifüj tüpünü kısaca vorteksleyin. Boncukları PD-1 ile karanlıkta RT’de (18-22 °C) döndürme (15-30 rpm) ile 2 saat inkübe edin. Boncukları Tahlil/Yıkama Tamponu (PBS-TBN: 1x PBS, pH 7,4 + %0,1 BSA + %0,05 Tween-20 + %0,05 NaN315) kullanarak iki kez (2x) yıkayın.Aktif boncukları içeren tüpü 1-2 dakika boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Süpernatanı, tüp hala manyetik ayırıcıya yerleştirilmişken, mıknatısla hareketsiz hale getirilmiş veya peletlenmiş boncuklardan bir pipetle aspire edin. Mikrosantrifüj tüpünü mıknatıstan çıkarın ve 100 μL Aktivasyon Tamponu ekleyin. Boncukları dağıtmak için reaksiyon tüpünü hafifçe döndürün. Toplam iki yıkama için 2.8.1-2.8.4 adımlarını bir kez daha tekrarlayın. Yıkama sonunda boncuklar, 10 × 106 boncuk/mL konsantrasyonda 100 μL Aktivasyon Tamponu içinde süspanse edilecektir.NOT: Tampon aynı zamanda bir depolama ortamı olarak kullanılmıyorsa, Tahlil / Yıkama tamponu sodyum azid (koruyucu) olmadan yapılabilir. rhPD-1 bağlantılı boncukları hemen kullanılmayacaksa karanlıkta buzdolabında 2-8 °C’de saklayın. Proteine bağlı boncuklar 18 aya kadar stabildir. 3. Boncuklara başarılı rhPD-1 bağlantısının değerlendirilmesi NOT: rhPD-1’e bağlı mikroküreler, biyotinile rhPD-L1 ile reaksiyona sokulur, ikincisi SAPE ile inkübasyon ve ardından akış sitometresinde bir değerlendirme ile tespit edilir. Bu, hem manyetik boncuklara başarılı PD-1 eşleşmesini hem de rhPD-1 ve rhPD-L1 proteinleri arasındaki fonksiyonel etkileşimi doğrular. PBS-TBN’de iki katlı bir seri seyreltme serisi biyotinillenmiş rhPD-L1 oluşturun (stok rhPD-L1 çözeltisi 1 mg / mL’dir). Test edilecek nihai rhPD-L1 konsantrasyon aralığı, 8 pg/mL’lik bir çözeltiye kadar 313 μg/mL’lik bir çözeltidir. Her rhPD-L1 seyreltmesi için 150 μL hacim oluşturun: her reaksiyon için 50 μL ve koşul başına iki reaksiyon artı pipetleme kayıplarını karşılamak için yeterli fazlalık.rhPD-L1 seyreltme mikrofüj tüplerini 8 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.25 μg/mL, 0.125 μg/mL, 0.063 μg/mL ve 0.031 μg/mL olarak etiketleyin. 0 μg/mL’lik bir tüp (yalnızca PBS-TBN), PD-L1 kontrolü olarak işlev görür. Etiketli tüm rhPD-L1 seyreltme tüplerine 150 μL PBS-TBN’yi önceden yükleyin.NOT: Test edilecek en yüksek nihai rhPD-L1 konsantrasyonu 8 μg/mL’dir ve rhPD-L1, reaksiyon karışımına eklendikten sonra 1:1 oranında seyreltilecektir, bu nedenle “8 μg/mL” etiketli seyreltme tüpü nihai konsantrasyonu ifade eder ve aslında 16 μg/mL rhPD-L1 içerir. Tüm seyreltme tüplerinin üzerindeki etiketler, reaksiyona eklendikten sonra nihai rhPD-L1 konsantrasyonunu gösterir. En yüksek konsantrasyonlu rhPD-L1 dilüsyonunu oluşturun (16 μg/mL gerçek). Bu, 1 mg / mL rhPD-L1 stok çözeltisinin (1.000 μg / 16 μg = 62.5) iki aşamalı, 62.5 kat seyreltilmesidir.84 μL PBS-TBN’yi 16 μL rhPD-L1 stok çözeltisi (1 mg/mL, yani 1.000 μL) ile bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Bu 6.25 kat seyreltmedir ve elde edilen konsantrasyon 160 μg/mL rhPD-L1’dir. “8 μg/mL” etiketli tüpte, 270 μL PBS-TBN’yi önceki adımda oluşturulan 30 μL rhPD-L1 seyreltmesi (160 μg/mL) ile birleştirin. Bu 10 katlık bir seyreltmedir ve ortaya çıkan konsantrasyon aslında 16 μg/mL’dir. “8 μg/mL” tüp etiketi, reaksiyona eklendikten sonraki son konsantrasyonunu ifade eder. Adım 3.1.3’te (“8 μg/mL”) oluşturulan rhPD-L1 seyreltmesinin 150 μL’sini “4 μg/mL” tüpüne aktarın, mikrosantrifüj tüp kapağını kapatın ve çözeltiyi karıştırmak için kısaca girdap yapın. rhPD-L3.1.4 seyreltme serisi tamamlanana kadar adım 1’ü sırayla tekrarlayın. Oluşturulduktan sonra, “8 μg/mL” ile “0.063 μg/mL” arasındaki tüm tüpler ve 0 μg/mL kontrolü 150 μL çözelti içermeli ve son tüp “0.031 μg/mL” 300 μL çözelti içermelidir. Bu, yinelenen reaksiyonlarda her bir biyotinile edilmiş rhPD-L1 seyreltmesinin 50 μL’sini test etmek için her bir seyreltmeden yeterli hacim oluşturur ve pipetleme kayıplarını karşılamak için yeterli fazlalık kalır. Bir hemositometre17 kullanarak rhPD-1’e bağlı boncukları sayın. Stok rhPD-1’e bağlı boncukları, 2.500 boncuk / 50 μL / reaksiyon için yeterli bir hacimle 5 × 104 boncuk / mL’ye seyreltin. 5 × 104 boncuk / mL rhPD-1-bağlı boncuk süspansiyonunu vorteksleyin ve 50 oyuklu yuvarlak tabanlı bir mikrotitre plakasının etiketli/eşlenmiş her bir kuyucuğuna süspansiyonun 1 μL’sini pipetleyin, böylece test edilen her rhPD-L1 seyreltmesi için çift kuyucuklar oluşturulur. Adım 3.1’de oluşturulan her bir biyotinile rhPD-L1 seyreltme tüpünden 50 μL’yi mikrotitre plakasındaki uygun kuyucuklara ekleyin. Mikrotitre plakasını tek kullanımlık bir folyo veya plastik yapışkan plaka kapatıcı ile örtün ve plakayı karanlıkta RT’de (18-22 °C) bir orbital çalkalayıcı (600 rpm) üzerinde 1 saat inkübe edin. Boncuklardan fazla biyotinile rhPD-L1’i yıkayın.Boncukları hareketsiz hale getirmek için sızdırmaz plakayı orbital çalkalayıcıdan manyetik plaka ayırıcıya 2 dakika boyunca aktarın. Yapışkan plaka kapatıcıyı dikkatlice çıkarın, mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bir arada olduğunu onaylayın ve plakayı ters çevirin ve süpernatantları uygun şekilde bir lavaboya veya biyolojik olarak tehlikeli sıvı atık kabına boşaltın. Kalan süpernatanı çıkarmak için ters çevrilmiş plakayı emici kağıt mendil yastığına hafifçe ama hızlı bir şekilde vurun. Mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıdan çıkarın ve her bir oyuğa 150 μL PBS-TBN pipetleyin. Boncukları hareketsiz hale getirmek için mühürsüz plakayı 2 dakika boyunca manyetik ayırıcıya yerleştirin. Mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bir arada olduğunu onaylayın ve plakayı ters çevirin ve süpernatantları uygun şekilde bir lavaboya veya biyolojik olarak tehlikeli sıvı atık kabına boşaltın. Kalan süpernatanı çıkarmak için ters çevrilmiş plakayı emici kağıt mendil yastığına hafifçe ama hızlı bir şekilde vurun. Her biri 150 μL PBS-TBN ile toplam üç yıkama için plaka yıkama adımları 3.7.3-3.7.5’i iki kez tekrarlayın. Son yıkama adımının sonunda kuyucuklarda süpernatan kalmadığından emin olun. Kuyu diplerinde hareketsiz boncukların kurumasını önlemek için sürekli çalışın. SAPE Algılama Reaktifi ekleyin.SAPE stok çözeltisini PBS-TBN’de 6 μg/mL’lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Tüm reaksiyon kuyucuklarının 100 μL/kuyu alabilmesi için yeterli bir SAPE çalışma çözeltisi hacmi hazırlayın ve pipetleme kayıplarını karşılamak için yeterli ekstra değer ekleyin. Mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıdan çıkarın. Her reaksiyon kuyucuğuna 100 μL SAPE çalışma solüsyonu ekleyin ve yıkanmış boncukları pipetleme ile yeniden süspanse edin. 96 oyuklu mikrotitre plakasını bir folyo veya plastik yapışkan plaka kapatıcı ile kapatın ve 600 rpm’de bir orbital çalkalayıcı üzerinde RT’de (18-22 °C) karanlıkta 1 saat inkübe edin. Mikrotitre plakasını inkübatörden çıkarın, boncukları hareketsiz hale getirmek için manyetik plaka ayırıcıya aktarın, yapışkan plaka kapatıcıyı çıkarın ve boncukları 150-3.7.3 adımlarında açıklandığı gibi 3.7.7.5 μL PBS-TBN ile üç kez yıkayın. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, plakayı manyetik plaka ayırıcıdan çıkarın ve boncukları oyuk başına 100 μL PBS-TBN’de yeniden süspanse edin. Sonuçları analiz edin.Aşağıdaki cihaz ayarlarını kullanarak her reaksiyonun medyan floresan yoğunluğunu (MFI) belirlemek için akış analiz cihazındaki plakayı okuyun ( Malzeme Tablosuna bakın): aspirasyon hacmi = 50 μL; minimum boncuk sayısı = 100 boncuk; zaman aşımı ayarı = 40 s; geçit = 7.000-17.000; çalışma modu = Tek Muhabir. Her koşul için yinelenen kuyular çalıştırılır ve daha fazla veri hesaplaması ve grafiği yapılmadan önce her koşul için iki çıkış MFI değerinin ortalaması alınır.NOT: Her seyreltmenin MFI değeri, boncuklara kabul edilebilir rhPD-1 bağlanma verimliliğini gösteren ve rekombinant PD-1/PD-L1 proteinlerinin iyi etkileşimini doğrulayan konsantrasyona bağlı bağlanma göstermelidir. 4. PD-L1 manyetik boncuk tabanlı PD-1 / PD-L1 engelleme testi NOT: Bu test, çözünür aracıların (örneğin, anti-PDL1-peptit antikorları) rekombinant PD1/PD-L1 etkileşimleri üzerindeki bloke edici aktivitesini değerlendirir. Kısaca biyotinile rhPD-L1, farklı PDL1-Vaxx peptit aşılamalarından sonra tavşanlarda üretilen antikorlarla önceden inkübe edilir. rhPD-L1 + anti-PDL1 antikor karışımı daha sonra rhPD-1-bağlı manyetik boncuklar kullanılarak yakalanır ve rhPD-L1’in rhPD-1-bağlı boncuklara bağlanması, streptavidin-PE ilavesiyle ölçülür. PE floresan sinyali, test edilen anti-PDL1 antikorlarının/inhibitörlerinin bloke edici aktivitesi ile ters orantılıdır. Anti-PDL1-peptit antikor bağlanması, aynı anda bir BV421-bağlı anti-tavşan (anti-PDL1-peptit antikorları için) veya anti-insan (kontrol antikorları için) ikincil antikorunun bağlanması ve BV421 floresansının değerlendirilmesi ile değerlendirilir. Test adımları Şekil 1’de resimsel olarak detaylandırılmıştır. PDL1-Vaxx ile indüklenen poliklonal antikor adayları, bir negatif kontrol antikoru (trastuzumab, Herceptin, insanlaştırılmış anti-HER2 monoklonal antikor) ve bir pozitif kontrol antikoru (atezolizumab; insanlaştırılmış anti-PDL1 IgG1 monoklonal antikor) dahil olmak üzere test antikorlarının iki katlı bir seri seyreltme serisini hazırlayın. Her reaksiyon, atanmış antikor seyreltmesinin 25 μL’sini kullanacaktır, bu nedenle gösterilen hacimler, her bir reaksiyonu koşul başına çift kuyucuklarda (yani koşul başına 50 μL) gerçekleştirmek için yeterlidir ve pipetleme kayıplarını karşılamak için bir miktar fazlalık kalır.Aşı ile indüklenen her anti-PDL1-peptit antikoru ve kontrol antikoru için, test edilen nihai antikor konsantrasyonlarının aralığının 1.000 μg/mL ila 8 μg/mL arasında olduğundan emin olun. 2.000 μg/mL’de tüm antikorların stok çözeltilerini hazırlayın. Her antikor için, seyreltme tüplerini 1.000 μg / mL, 500 μg / mL, 250 μg / mL, 125 μg / mL, 63 μg / mL, 31 μg / mL, 16 μg / mL ve 8 μg / mL olarak etiketleyin ve antikor adını ekleyin. Her antikor için, yalnızca araç (PBS-TBN) kontrolü olacak bir “0 μg/mL” tüpü de ekleyin.NOT: Reaksiyon karışımına eklendiğinde, antikor konsantrasyonu 1:1 oranında seyreltilecektir. Antikor seyreltme tüpleri, reaksiyona eklendikten sonra nihai antikor konsantrasyonu olarak etiketlenir ve aslında etiketlenenden iki kat daha fazla antikor içerir. “0 μg/mL” araç kontrol tüpleri de dahil olmak üzere “500 μg/mL” ve altındaki tüm antikor seyreltme tüplerine 75 μL PBS-TBN ekleyin. Her antikor için, 2.000 μg / mL stok çözeltisinin 150 μL’sini “1.000 μg / mL” etiketli ilgili tüpe pipetleyin. Bu, her bir antikor için sonraki tüm dilüsyonları yapmak için kullanılacaktır. Her antikor için, “1.000 μg/mL” tüpten 75 μL’yi serideki bir sonraki düşük seyreltme (yani “500 μg/mL”) ile tüpe pipetle aktararak tam bir seyreltme serisi oluşturun. Yeni tamamlanan seyreltme tüpünü kapatın, kısaca vorteksleyin ve “500 μg/mL” tüpten “250 μg/mL” tüpe 75 μL aktararak seyreltme serisinin yapımına devam edin. Tüm antikorlar için son seyreltme olan “8 μg/mL” yapılana kadar bu modeli tekrarlayın.NOT: Her antikor için tamamlanmış seyreltme serisinde, 150 μL’lik bir hacim içermesi gereken en düşük seyreltme olan 8 μg/mL hariç tüm tüpler için 75 μL’lik bir hacim olmalıdır. Her reaksiyon 25 μL antikor seyreltmesi kullanacaktır, bu nedenle bu hacimler, pipetleme kayıplarını karşılamak için ekstra olmak üzere, her bir reaksiyonu koşul başına çift kuyucuklarda (yani koşul başına 50 μL) gerçekleştirmek için yeterlidir. 25 μL seyreltilmiş antikorları 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının belirlenmiş kuyucuklarına yerleştirin. Biyotinile rhPD-L1’i, PBS-TBN’de 4 μg/mL’lik bir çalışma konsantrasyonuna, koşul başına çift kuyucuklara 25 μL içerecek kadar yeterli bir hacimde seyreltin (yani, koşul başına 50 μL), pipetleme kayıplarını karşılamak için ekstra.NOT: Bu çalışmada, 4 μg/mL’de biyotinile rhPD-L1, önceki kuplaj değerlendirmesinde ölçülen maksimum MFI sinyalinin yaklaşık ‘si ile sonuçlandı ve PD-1/PD-L1 blokaj analizi için kullanıldı. Her reaksiyon kuyucuğuna 25 μL biyotinile rhPD-L1 (4 μg/mL) ekleyin, mikrotitre plakasını bir folyo veya plastik yapışkan conta ile kapatın ve RT’de (18-22 °C) 1 saat boyunca 600 rpm’de bir orbital plaka çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. rhPD-1’e bağlı boncukları, 50 μL/kuyucuk (2.500 boncuk/kuyu) için yeterli hacim ve pipetleme kayıplarını karşılamak için ekstra olacak şekilde 50.000 boncuk/mL’ye seyreltin. 96 oyuklu mikrotitre reaksiyon plakasını çalkalayıcıdan çıkarın ve yapışkan plaka contasını çıkarın. Her oyuğa 50 μL rhPD-1 bağlı boncuk karışımı ekleyin. Plakayı kapatın ve karanlıkta RT’de (18-22 °C) 600 rpm’de bir orbital çalkalayıcıda 1 saat inkübe edin. Boncukları hareketsiz hale getirmek için sızdırmaz plakayı orbital çalkalayıcıdan manyetik plaka ayırıcıya 2 dakika boyunca aktarın. Yapışkan plaka kapatıcıyı dikkatlice çıkarın, mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bir arada olduğunu onaylayın ve plakayı ters çevirin ve süpernatanları boşaltın. Fazla süpernatanı çıkarmak için ters çevrilmiş plakayı emici kağıt mendil yastığına hafifçe vurun. Boncuklardaki fazla reaksiyon reaktiflerini yıkayın.Mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıdan çıkarın ve her oyuğa 150 μL PBS-TBN ekleyin. Boncukları hareketsiz hale getirmek için mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıya 2 dakika yerleştirin. Mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bir arada olduğunu onaylayın ve plakayı ters çevirin ve süpernatantları boşaltın. Fazla süpernatanı çıkarmak için ters çevrilmiş plakayı emici kağıt mendil yastığına hafifçe vurun. PBS-TBN ile toplam üç yıkama için plaka yıkama adımları 4.11.1-4.11.3’ü iki kez tekrarlayın. Son (üçüncü) yıkama solüsyonunu çıkarmadan önce SAPE reaktifinin (aşağıda) hazırlandığından emin olun. SAPE algılama reaktifini ekleyin.Stok SAPE stok çözeltisini PBS-TBN’de 6 μg/mL çalışma konsantrasyonuna seyreltin; 100 μL/kuyu için yeterli bir hacim ve pipetleme kayıplarını karşılamak için ekstra hacim yapın. Her reaksiyon kuyucuğuna 100 μL/kuyu SAPE çalışma solüsyonu ekleyin ve pipetleme ile boncukları yeniden süspanse edin. Plakayı kapatın ve karanlıkta RT’de (18-22 °C) 600 rpm’de bir orbital çalkalayıcıda 1 saat inkübe edin. Fazla SAPE’yi reaksiyondan boşaltın.Boncukları hareketsiz hale getirmek için sızdırmaz plakayı orbital çalkalayıcıdan manyetik plaka ayırıcıya 2 dakika boyunca aktarın. Yapışkan plaka kapatıcıyı dikkatlice çıkarın, mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bir arada olduğunu onaylayın ve plakayı ters çevirin ve süpernatanı boşaltın. Fazla SAPE içeren süpernatanı çıkarmak için ters çevrilmiş plakayı emici bir kağıt mendil yastığına hafifçe vurun. Fazla SAPE’yi boncuklardan yıkayın.Mikrotitre plakasını manyetik plaka tutucusundan çıkarın. Boncukları yeniden süspanse etmek için her oyuğa 150 μL PBS-TBN ekleyin. Boncukları hareketsiz hale getirmek için mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıya 2 dakika yerleştirin. Mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bir arada olduğunu onaylayın ve plakayı ters çevirin ve süpernatanı boşaltın. Fazla süpernatanı çıkarmak için ters çevrilmiş plakayı emici kağıt mendil yastığına hafifçe vurun. 4.15.1-4.15.4 adımlarını tekrarlayarak toplam üç yıkama için PBS-TBN ile iki ek yıkama adımı gerçekleştirin. Son (üçüncü) yıkama solüsyonunu çıkarmadan önce BV421 konguge ikincil tespit antikorlarını hazırlayın (bir sonraki adım). BV421 ile konguge edilmiş sekonder antikorları ekleyin.BV421 ile konguge anti-insan IgG’yi (insanlaştırılmış kontrol antikorlarını tespit etmek için) ve BV421 ile konguge anti-tavşan IgG’yi (PDL1-Vaxx ile indüklenen poliklonal antikorları tespit etmek için) seyreltin (Malzeme Tablosuna bakın) Yıkama/Tahlil Tamponunda 1:400 oranında her birinden 100 μL/kuyucuk kullanmak için yeterli hacimlerde, pipetleme kayıplarını karşılamak için ekstra. Uygun kuyucuklara 100 μL seyreltilmiş BV421-konjuge anti-insan IgG veya BV421-konjuge anti-tavşan IgG ekleyin. Plakayı kapatın ve karanlıkta RT’de (18-22 °C) 600 rpm’de bir orbital çalkalayıcıda 1 saat inkübe edin. Boncuklardan fazla BV421 konjuge sekonder antikorları boşaltın.Boncukları hareketsiz hale getirmek için sızdırmaz plakayı orbital çalkalayıcıdan manyetik plaka ayırıcıya 2 dakika boyunca aktarın. Yapışkan plaka kapatıcıyı dikkatlice çıkarın, mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bir arada olduğunu onaylayın ve plakayı ters çevirin ve süpernatanı boşaltın. Fazla BV421 konjuge sekonder antikorları içeren süpernatanı çıkarmak için ters çevrilmiş plakayı bir emici kağıt mendil yastığına hafifçe vurun. Fazla BV421 konjuge sekonder antikorları boncuklardan yıkayın.Boncukları yeniden süspanse etmek için her oyuğa 150 μL PBS-TBN ekleyin. Boncukları hareketsiz hale getirmek için mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıya 2 dakika yerleştirin. Mıknatıs ve mikrotitre plakasının güvenli bir şekilde bir arada olduğunu onaylayın ve plakayı ters çevirin ve süpernatanı boşaltın. Fazla süpernatanı çıkarmak için ters çevrilmiş plakayı emici kağıt mendil yastığına hafifçe vurun. 4.19.1-4.19.3 adımlarını tekrarlayarak toplam dört yıkama için PBS-TBN ile üç ek yıkama adımı gerçekleştirin. Son (dördüncü) yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, mikrotitre plakasını manyetik plaka ayırıcıdan çıkarın ve boncukları bir pipetleyici ile 100 μL PBS-TBN/kuyucuğunda yeniden süspanse edin. Sonuçları analiz edin.Aşağıdaki cihaz ayarlarını kullanarak her reaksiyonun MFI’sini belirlemek için çift raportörlü akış analiz sistemindeki plakayı okuyun: aspirasyon hacmi = 50 μL; minimum boncuk sayısı = 100 boncuk; zaman aşımı ayarı = 40 s; geçit: 7.000-17.000; çalışma modu = Çift Muhabir. Çift raportör sistemiyle, Reporter Channel 1’in turuncu PE floresansını (rhPD-1-konjuge boncuklara bağlı rhPD-L1 miktarı) ve Reporter Channel 2’nin mavi BV421 floresansını (rhPD-L1’e bağlı bağlı bloke edici antikor miktarı) ölçtüğünden emin olun. Her koşul için yinelenen kuyular çalıştırın ve daha fazla veri hesaplaması ve grafiği gerçekleştirmeden önce her koşul için iki çıkış MFI değerinin ortalamasını alın. Her numunenin MFI değerini negatif kontrole standartlaştırın ve her numune için inhibisyon yüzdesini hesaplayın:İnhibisyon% = (100 × [Negatif Kontrol MFI – Örnek MFI])/Negatif Kontrol MFINOT: Negatif kontrol MFI değerleri (inhibisyon yok) en yüksek değerlerdir; bağlı PD-L1 sinyali MFI 0’dür ve rhPD-L1’in rhPD-1’e bağlanmasının inhibisyonu %0 olarak tanımlanır. Şekil 1: Çift raportörlü PD-1/PD-L1 blokaj testinin şeması. Biyotinillenmiş rekombinant insan PD-L1 (rhPD-L1), PD-1 / PD-L1 kontrol noktası kompleksi oluşumuna izin vermek için rhPD-1 bağlantılı manyetik boncuklarla birleştirilmeden önce seçilmiş PDL1-Vaxx ile indüklenen anti-PDL1 antikorları ile önceden inkübe edilir. Kompleks rhPD-L1 daha sonra streptavidin bağlı fikoeritrin (SAPE, turuncu florofor) ilavesiyle tespit edilir ve işaretlenir. PDL1-Vaxx epitoplarına karşı antikorlar, manyetik boncuklara önceden bağlanmış rhPD-1’e kompleks oluşturan rhPD-L1’i hedefler ve bunlar bir Brilliant Violet 421-konjuge ikincil antikor (BV421, mavi florofor) kullanılarak aydınlatılır. Hem PD-1’e (PE sinyali) kompleks haline getirilmiş biyotinile rhPD-L1 hem de rhPD-L1’i (BV421 sinyali) tanıyan ve bağlayan anti-PDL1 antikorları, iki ayrı raportör kanalında her iki florofor için numuneleri sorgulayan çift raportörlü bir akış sitometrik alet kullanılarak eşzamanlı olarak analiz edilir. Her numune için çıktı değerleri, her bir floroforun medyan floresan yoğunluğudur. PDL1-Vaxx ile indüklenen antikorlar tarafından PD1/PD-L1 kompleks oluşumunun inhibisyonu daha sonra deneysel sinyallerin rhPD-L1’i bağlamayan negatif bir kontrol monoklonal antikoru kullanılarak üretilenlerle karşılaştırılmasıyla tahmin edilir (%0 inhibisyon). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.