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Bioengineering

Ex Vivo Culture de perfusion de gros vaisseaux sanguins dans un bioréacteur imprimé en 3D

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65465
, , , , ,
1Department of Biochemical Sciences, School of Biosciences,University of Surrey, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, School of Biosciences,University of Surrey

Summary

Ce protocole présente la mise en place et le fonctionnement d’un bioréacteur nouvellement développé, imprimé en 3D, pour la culture ex vivo de vaisseaux sanguins en perfusion. Le système est conçu pour être facilement adopté par d’autres utilisateurs, pratique, abordable et adaptable à différentes applications expérimentales, telles que la biologie fondamentale et les études pharmacologiques.

Abstract

Les maladies vasculaires sont à la base de la plupart des maladies cardiovasculaires (MCV), qui restent la première cause de mortalité et de morbidité dans le monde. Des interventions chirurgicales et pharmacologiques efficaces pour prévenir et traiter les maladies vasculaires sont nécessaires de toute urgence. En partie, le manque de modèles translationnels limite la compréhension des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans les maladies vasculaires. Les bioréacteurs de culture de perfusion ex vivo offrent une plate-forme idéale pour l’étude de grands vaisseaux animaux (y compris humains) dans un environnement dynamique contrôlé, combinant la facilité de la culture in vitro et la complexité du tissu vivant. La plupart des bioréacteurs sont cependant fabriqués sur mesure et donc difficiles à adopter, ce qui limite la reproductibilité des résultats. Cet article présente un système imprimé en 3D qui peut être facilement produit et appliqué dans n’importe quel laboratoire biologique, et fournit un protocole détaillé pour sa configuration, permettant aux utilisateurs de l’utiliser. Ce système de culture de perfusion ex vivo innovant et reproductible permet la culture de vaisseaux sanguins jusqu’à 7 jours dans des conditions physiologiques. Nous nous attendons à ce que l’adoption d’un bioréacteur de perfusion normalisé favorise une meilleure compréhension des processus physiologiques et pathologiques dans les gros vaisseaux sanguins des animaux et accélère la découverte de nouveaux traitements.

Introduction

La paroi vasculaire existe dans un état d’équilibre réactif, ce qui assure à la fois des réceptivités aux stimuli externes (c’est-à-dire un changement de pression, des vasoconstricteurs) et une surface constante non activatrice empêchant la coagulation sanguine et l’infiltration de cellules inflammatoires1. En réponse à des stimuli liés au vieillissement et au mode de vie et à des dommages directs, la paroi vasculaire active des processus de remodelage tels que la resténose et l’athérosclérose, qui sont des contributeurs connus aux maladies cardiovasculaires courantes (MCV), telles que l’accident vasculaire cérébral ischémique et l’infarctus du myocarde2. Bien que des approches interventionnelles telles que la revascularisation percutanée et la pose d’endoprothèses soient disponibles pour lutter contre les manifestations avancées de la maladie vasculaire, elles sont connues pour provoquer d’autres lésions vasculaires, conduisant souvent à des récidives. De plus, seules des solutions préventives et précoces limitées sont disponibles. Comprendre les mécanismes qui maintiennent l’homéostasie de la paroi vasculaire et pilotent son dysfonctionnement est au cœur du développement de nouveaux remèdes3.

Malgré le développement et les progrès constants de la biologie moléculaire et de l’ingénierie tissulaire, les études animales restent une composante cruciale des études de biologie vasculaire. Des études in vivo chez l’animal ont permis de mieux comprendre les mécanismes de l’homéostasie vasculaire et de la pathologie. Cependant, ces procédures sont coûteuses, ont un débit relativement faible et posent des problèmes éthiques importants. De plus, les petits animaux sont peu représentatifs de la physiologie vasculaire humaine, et les expériences sur les grands animaux sont beaucoup plus coûteuses et créent d’autres considérations éthiques 4,5. Avec la demande croissante de solutions pharmaceutiques et médicales pour une population vieillissante rapide, les inconvénients de l’utilisation d’animaux sont amplifiés, ce qui a un impact sur la reproductibilité, la fiabilité et la transférabilité des résultats pour les soins aux patients6.

Les systèmes in vitro offrent une plate-forme simplifiée pour étudier les mécanismes de base, mais ne parviennent pas à récapituler la complexité de l’ensemble du tissu, les interactions entre les cellules et la matrice extracellulaire, et les forces mécaniques, qui sont des déterminants critiques dans le développement des maladies vasculaires7.

Les études ex vivo réalisées sur des tissus entiers maintenus dans des environnements contrôlés artificiellement imitent la complexité in vivo tout en permettant des investigations à débit relativement élevé8. Compte tenu de la capacité à contrôler étroitement les conditions de culture et l’environnement, les modèles ex vivo permettent un large éventail d’études complexes et offrent une alternative appropriée pour réduire l’utilisation de procédures animales en biologie vasculaire. Les cultures d’anneaux vasculaires statiques ont offert des informations intéressantes, mais n’ont pas réussi à intégrer l’élément hémodynamique crucial9. En effet, l’étude ex vivo du système vasculaire pose des défis spécifiques liés aux nombreuses forces dynamiques qui s’appliquent aux cellules de la paroi des vaisseaux sanguins. Les stimuli tels que l’écoulement luminal, la turbulence, la contrainte de cisaillement, la pression et la déformation de la paroi ont un impact significatif sur la physiopathologie tissulaire10,11,12.

Les bioréacteurs de perfusion sont essentiels pour étudier l’homéostasie vasculaire et le remodelage en réponse à une blessure ou à des changements hémodynamiques13. De plus, la culture par perfusion peut être utilisée pour améliorer la maturation et la durabilité des vaisseaux sanguins issus de l’ingénierie tissulaire (TEBV), offrant ainsi des alternatives appropriées pour les greffes vasculaires14.

Les bioréacteurs de perfusion disponibles dans le commerce ont une flexibilité et une adaptabilité limitées et sont coûteux. De nombreux bioréacteurs existants développés en interne sont difficiles à reproduire dans d’autres laboratoires, en raison des descriptions limitées et de l’indisponibilité des composants spécialement fabriqués 7,8,9,10,11,12. Pour surmonter ces limitations, nous avons récemment mis au point un nouveau bioréacteur (EasyFlow), qui est économique à produire, qui s’adapte à une gamme de tissus et permet des modifications relativement simples pour s’adapter aux différentes exigences de la recherche13. L’insert est imprimé en 3D et s’adapte comme dans le couvercle d’un tube à centrifuger standard de 50 ml. Sa conception modulaire et sa fabrication par impression 3D le rendent accessible et reproductible dans différents laboratoires, ainsi que facilement modifiable pour s’adapter aux différents besoins scientifiques. Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement de base du système de bioréacteur dans un contexte de perfusion artérielle.

Protocol

Ce protocole décrit l’assemblage et l’utilisation d’un système composé de deux inserts EasyFlow (bioréacteur) : l’un représentant la chambre de réaction (C), contenant l’échantillon d’artère perfusée, et l’autre fonctionnant comme réservoir de milieu (R) (Figure 1 et Figure 2A). Les artères carotides ont été prélevées sur des porcelets mâles et femelles âgés de 4 à 6 semaines (6 à 12 kg) à l’Institut Pirbright, au Royaume-Uni. Les procédures relatives aux animaux ont été effectuées en vertu de la loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) du ministère de l’Intérieur (ASPA) et approuvées par le Comité d’examen du bien-être animal et de l’éthique (AWERB) de l’Institut Pirbright. Les animaux ont été logés conformément au Code de pratiques pour l’hébergement et les soins des animaux de race. Toutes les procédures ont été effectuées par des titulaires de licence personnelle formés et compétents en vertu de la licence de projet PPL70/8852. Les porcelets ont été réformés selon la méthode de l’annexe 1 en vertu de l’ASPA. 1. Fabrication d’inserts Fabriquez l’insert par impression 3D, à l’aide du modèle 3D fourni (Fichier supplémentaire 1).REMARQUE : La modélisation 3D permet de modifier facilement la conception pour s’adapter à de nouvelles applications. Des matériaux alternatifs et des techniques de fabrication alternatives peuvent également être utilisés pour produire l’insert. En raison de la structure interne complexe, le frittage sélectif par laser et la stéréolithographie sont des alternatives appropriées15. Le polyamide 12 (PA12 ; voir tableau des matériaux) est un bon matériau candidat en raison de ses performances supérieures en termes de rétention d’eau et de résistance aux cycles répétés de stérilisation thermique16. Fabriquer les joints en silicone et les rondelles en polycarbonate par découpe au laser17, en utilisant les dessins fournis dans le fichier supplémentaire 2.REMARQUE : La découpe au laser est facilement externalisée et constitue une méthode de fabrication bon marché. Les rondelles peuvent être fabriquées en acier inoxydable, ce qui en fait un composant plus résistant pour une utilisation répétée. Tous les autres composants sont des articles disponibles dans le commerce. Une liste complète des matériaux requis est fournie dans le tableau 1. Les détails commerciaux des articles sont inclus dans le tableau des matériaux. 2. Stérilisation, assemblage et amorçage de l’appareil Stérilisez tous les composants en suivant les instructions du tableau 1. Dans des conditions d’écoulement laminaire, assemblez deux inserts fabriqués (étape 1), comme illustré à la figure 1A. Assemblez le système de perfusion comme indiqué à la figure 2, en suivant les étapes ci-dessous :Fixez deux vannes à trois voies connectées à l’orifice R1 du réservoir (orifice d’échange de média). Connectez la sortie résultante à la tête de la pompe péristaltique à l’aide d’un tube équipé d’une vanne unidirectionnelle (tube vanne unidirectionnelle). Connectez la tête de pompe à l’orifice C4 de la chambre de réaction à l’aide d’un tube système équipé d’une vanne unidirectionnelle.REMARQUE : Cette branche peut être équipée en option d’un capteur de pression permettant une surveillance constante. Connectez l’orifice de la chambre de réaction C1 à un tube à paroi souple, et ce au canal de résistance (petit diamètre intérieur).REMARQUE : La longueur du tube de résistance influencera grandement la pression présente dans le système. Cela devrait faire l’objet d’une étude plus approfondie pour assurer des conditions de perfusion adéquates. Prolongez le canal de résistance avec le tube du système, en créant un canal de retour et en fermant la boucle de circulation luminale en vous connectant au réservoir à R5 (Figure 2C). Créez un canal de débordement en connectant la chambre de réaction C3 au réservoir R3 à l’aide d’un tube système. Fixez un filtre de ventilation à travers R2. Créez un amortisseur de pression en connectant une seringue contenant de l’air et du fluide à la chambre de réaction C6.REMARQUE : Le rapport air/fluide correct dépendra de l’amortissement de pression requis. Amorcer le système avec un milieu de perfusion (milieu d’aigle modifié de Dulbecco [DMEM] + 10 % [v/v] sérum de veau fœtal [FBS] + 1 % [v/v] pénicilline-streptomycine + 1 % [v/v] amphotéricine B + 30 % [v/v] dextran ; voir le tableau des matériaux) à travers les ports d’échange de milieux et le réservoir.REMARQUE : L’amorçage du système réduit le risque de piégeage de bulles dans le système et identifie toute fuite potentielle. Le volume recommandé de média est d’environ 100 à 120 ml. Le volume utilisé dépendra du volume mort de la tubulure utilisée pour l’expérimentation. 3. Récolte et préparation des échantillons Prélever les artères carotides communes gauche et droite, en minimisant la manipulation directe du tissu artériel13. Placer le tissu dans un milieu de transport froid (DMEM + 20 % [v/v] FBS + 2 % [v/v] pénicilline-streptomycine + 1 % [v/v] amphotéricine B, voir le tableau des matériaux) pour le transfert. Dans une armoire à flux laminaire, retirez l’excès de tissu conjonctif et coupez les extrémités du tissu à l’aide d’une lame de scalpel. Lavez le mouchoir deux fois dans un milieu de transport froid. Placez les mouchoirs sur un agitateur orbital dans un milieu de transport pendant au moins 30 minutes pour un lavage en profondeur. Connectez un segment non ramifié de l’artère au système de bioréacteur à l’aide de deux connecteurs Luer barbelés et fixez-le en place à l’aide d’une liaison vasculaire (attaches vasculaires en silicone ; Tableau 1).REMARQUE : La liaison du récipient fournit la tension et la rétraction appropriées pour sécuriser le navire. La section ovale prévient les lésions tissulaires. Faites couler doucement le milieu dans l’artère pour vérifier la perméabilité. Après avoir fixé l’artère à l’insert fabriqué, remplissez l’espace de réaction avec un milieu de perfusion (étape 2.4). Enfin, remplissez doucement la boucle de circulation luminale avec du média pour éliminer tout air restant du système. Connectez l’espace de réaction avec le système de perfusion précédemment assemblé (section 2), complétant ainsi la circulation.REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer un contrôle de qualité par immunohistochimie des tissus traités. Cela permet d’identifier tout dommage dû à une manipulation excessive lors de la préparation. 4. Culture de perfusion et changement des milieux Placer le système de perfusion dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 , puis le connecter à une pompe péristaltique (voir tableau des matériaux) Connectez tous les systèmes d’acquisition supplémentaires (facultatifs), tels que les capteurs de pression (voir le tableau des matériaux). Laissez le système s’équilibrer pendant la nuit avec un faible débit de ~10-15 mL/min.REMARQUE : Des expériences initiales pour déterminer les réglages de la pompe, le débit du fluide, la pression du système et les réglages optimaux des amortisseurs de pression/colliers sont nécessaires pour s’assurer que les conditions appropriées sont remplies. Le lendemain, augmentez le débit progressivement (+1 tr/min toutes les heures, équivalent à une augmentation de ~2,5 mL/min toutes les heures, dans le système actuel) jusqu’à ce que le débit final (35 mL/min) soit atteint. Surveillez périodiquement le système pour détecter les fuites.REMARQUE : Pour calculer le débit précis en fonction de la vitesse de la pompe péristaltique, les utilisateurs doivent d’abord effectuer un étalonnage adéquat de la pompe18. À l’aide de la formule (1), le débit volumétrique (Q) peut être calculé sur la base du volume distribué (V) dans un temps donné (t). Pour calculer la vitesse d’écoulement estimée (), nous pouvons utiliser le débit (Q) calculé précédemment et l’aire de la section transversale du navire (A), décrite dans l’équation (2).(1)(2) Tous les 3 jours, remplacez 50 % du milieu (~50 ml) en raccordant une seringue remplie de milieux frais à l’orifice d’échange de milieux le plus proche de la pompe et une seringue vide à l’orifice le plus proche du réservoir pour recueillir le milieu usé (Figure 2).REMARQUE : L’utilisation de deux vannes à trois voies comme orifices d’échange de milieu facilite le fonctionnement continu de la perfusion pendant l’échange de milieu. À la fin de l’expérience, prélevez le tissu de la chambre de réaction en coupant les extrémités reliées au bioréacteur à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles. Démontez, nettoyez et stérilisez le système pour une utilisation ultérieure. 5. Analyse de l’échantillon Fixer l’échantillon prélevé dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant une nuit à 4 °C. Imprégner le tissu à une température de coupe optimale (OCT ; voir le tableau des matériaux)19 et le congeler par immersion dans de l’isopentane refroidi dans de l’azote liquide. Obtenir des cryo-sections de 3 à 5 mm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat. Effectuer l’immunohistochimie (hématoxyline et éosine [H&E]) et/ou l’immunofluorescence. Suivez le protocole d’immunofluorescence typique :Bloquer les tranches pendant 1 h à température ambiante avec 20 % [v/v] de sérum de chèvre dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; voir tableau des matériaux). Incuber les tranches pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires de lapin contre CD31 dilués à 1 :50 dans du PBS (voir le tableau des matériaux). Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min. Incuber pendant 1 h à 37 °C avec un anticorps secondaire anti-lapin de chèvre marqué par fluorescence dilué 1 :200 dans du PBS et un anticorps fluorescent à conjugaison directe du muscle lisse (SMA) α 1 :200 dans du PBS (voir le tableau des matériaux). Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min. Colorer les noyaux avec du DAPI dilué 1 :1 000 dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. Incuber avec 0,1 % (p/v) de noir de Soudan (voir le tableau des matériaux) dans de l’éthanol à 70 % (v/v) pendant 10 minutes à température ambiante pour réduire l’autofluorescence des tissus. Lavez le tissu avec de l’eau déminéralisée abondante. Montez les glissières dans le support de montage. Imagez les échantillons à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.

Representative Results

Cette étude a permis de mettre au point un système de perfusion polyvalent et abordable (EasyFlow)13. La conception imprimée en 3D du système facilite l’adoption du système par d’autres laboratoires et favorise donc la reproductibilité. L’insert de perfusion fabriqué est logé dans un tube à centrifuger de 50 ml, créant ainsi un environnement isolé. À l’aide de deux inserts de perfusion, il est possible d’établir une boucle de perfusion contenant un réservoir et une chambre de réaction, où l’échantillon biologique est incubé. Le système de perfusion est ensuite relié à une pompe péristaltique et à des systèmes d’acquisition en option, tels que des capteurs de pression et des appareils à ultrasons, pour surveiller les conditions de culture (figure 2). Des échantillons d’artère carotide porcine ont été prélevés et traités avant d’être mis en culture en perfusion pendant 7 jours. Pour s’assurer de la qualité du tissu avant la culture, des expériences préliminaires ont été effectuées où les échantillons ont été fixés au moment de l’excision, après la préparation des tissus et après la perfusion. La coloration fluorescente des marqueurs endothéliaux (CD31) et des muscles lisses (αSMA) a été utilisée pour évaluer le maintien de l’intégrité des tissus. Des exemples de tissus bien conservés et endommagés sont présentés à la figure 3 à des fins de comparaison. Les images montrent l’importance d’une manipulation délicate du tissu au moment de l’excision, car un traitement incorrect (étirement excessif, écrasement, etc.) peut entraîner une perte de l’endothélium avant la culture. Les résultats montrent également l’importance de l’établissement progressif de la perfusion pour éviter les dommages luminaux. La coloration H&E a été réalisée en même temps que la coloration par immunofluorescence (IF) pour montrer le maintien de la morphologie et de la distribution globale des cellules dans la paroi vasculaire après 7 jours de culture (Figure 4). L’application de conditions physiologiques de culture dans l’appareil assure le maintien de la couverture endothéliale de la lumière, l’alignement des cellules musculaires lisses dans le milieu et la préservation du vasa vasorum dans l’adventice. La conception compacte et modulaire du système de bioréacteur permet également une large gamme de configurations de système. La configuration plus petite comprend un seul bioréacteur et est idéale pour les études pharmacologiques et à faible volume (perfusion en recirculation 20, volume total de 50 à70 ml). Pour augmenter la durée de la culture et réduire le nombre de changements de milieu, un système de circulation à réservoir unique, comme celui décrit dans ce protocole, ou un système d’alimentation constante est plus idéal, car ils ont un plus grand volume de milieu en circulation. Une configuration à double circulation21 peut être mise en place pour explorer des contextes expérimentaux où la localisation des stimuli est critique. L’appareil actuel peut également être combiné avec des systèmes de contrôle plus sophistiqués pour permettre un contrôle précis par rétroaction de paramètres tels que le pH et l’oxygène dissous (Figure 5). Figure 1 : Schémas d’assemblage d’EasyFlow. (A) Schémas rendus en 3D facilitant l’assemblage de l’insert de perfusion. (B) Des schémas détaillés sont fournis pour faciliter l’assemblage des sites de raccordement. (C) Une vue en coupe de l’espace de réaction met en évidence les composants essentiels de l’insert EasyFlow et la connexion du tissu à l’insert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Représentation schématique de l’assemblage du système de perfusion. (A) Système de perfusion assemblé contenant tous les composants importants, mettant en évidence leur position relative dans un environnement rendu en 3D. Tous les composants ne sont pas évolutifs. (B) Des vues isométriques individuelles des composants sont également présentées. (C) Une vue de dessus du système de perfusion assemblé est montrée pour faciliter l’assemblage et la connexion des différents composants. Les ports ont été étiquetés et numérotés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour naviguer entre les différents sites de connexion du système de perfusion. Ce principe a été appliqué au réservoir (R) et à la chambre de réaction (C). Les différents canaux reliant les deux chambres ont également reçu des noms à titre de référence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Entretien des tissus pendant le traitement. (A) Les images confocales montrent la structure normale d’une artère au moment de la récolte, (B) après nettoyage et traitement, et (C) après culture de perfusion, démontrant le maintien d’une morphologie bien préservée. (D) Des exemples de tissus endommagés en raison d’une manipulation excessive ou incorrecte pendant le traitement ou (E) en raison de l’application de conditions de culture non physiologiques (c.-à-d. l’amorce soudaine d’un débit élevé) montrent un épuisement de la couverture luminale et une perturbation du milieu. (F) Un contrôle négatif indique la spécificité de la coloration. CD31 : vert ; αSMA : rouge ; DAPI : bleu. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Évaluation histologique des tissus avant et après culture de perfusion. (A et B) Le tissu artériel a été évalué par histologie au moment du prélèvement et (C et D) après 7 jours de culture avec le système de bioréacteur. (A et C) La coloration H&E révèle la préservation de la structure et de l’organisation de la paroi artérielle. (B et D) La coloration par immunofluorescence du même tissu met en évidence la couverture endothéliale, l’alignement des cellules musculaires lisses et le vasa vasorum dans l’adventice. CD31 : vert ; SMA : rouge ; DAPI : bleu. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Représentation schématique des configurations de perfusion possibles. Diverses configurations alternatives peuvent être adaptées à l’insert de perfusion pour permettre différentes études expérimentales. (A) Le système de recirculation de perfusion minimise le volume de milieu requis. (B) La configuration d’alimentation constante fournit un apport constant de milieu aux tissus. (C) La circulation dans un seul réservoir (telle qu’elle est décrite dans le présent document) fournit un plus grand volume de milieux pour les incubations à long terme et comprend une zone tampon pour l’échange d’air et l’équilibrage de la pression. (D) La configuration à double circulation fournit deux boucles distinctes alimentant indépendamment les circulations interne (à l’intérieur de l’artère) et externe (espace réactionnel). (E) La configuration de perfusion dynamique comprend des gaz continus et un contrôle du pH par un contrôleur proportionnel-intégral-dérivé (PID). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Tableau 1 : Composants pour la fabrication des inserts. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. Fichier complémentaire 1 : modèle 3D de l’insert EasyFlow pour la fabrication d’impression 3D. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 2 : Schémas de conception de l’appareil construit, vue en coupe, impression et composants d’étanchéité. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les systèmes de perfusion vasculaire ex vivo constituent une plate-forme unique pour étudier la fonction et le comportement des cellules vasculaires dans leurs tissus natifs dans des conditions contrôlées, ce qui permet de disséquer des processus complexes tels que le remodelage vasculaire post-lésion22. Cependant, la plupart des bioréacteurs signalés sont des systèmes fabriqués en interne et basés sur des composants sur mesure et sont souvent difficiles à reproduire par d’autres23. D’autres solutions commerciales existent, mais elles manquent de souplesse dans la conception et peuvent être relativement coûteuses24.

Nous avons développé un système alternatif qui fournit une plate-forme simple, bon marché et reproductible qui peut être fabriquée à l’aide de techniques d’impression 3D open source13. Le présent article décrit la configuration du système pour permettre aux utilisateurs finaux d’utiliser des applications reproductibles. Cette configuration permet d’appliquer des conditions physiologiques et pathologiques de pression (40-180 mmHg), de débit (6-30 mL/min) et, en combinaison avec des fluides imitant la viscosité du sang, avec différents degrés de contrainte de cisaillement.

La reproductibilité est un aspect essentiel du processus scientifique, car elle permet aux chercheurs de valider les résultats des autres et de s’en inspirer pour faire progresser notre compréhension des maladies vasculaires. De plus, les outils qui permettent et favorisent les collaborations entre les groupes sont essentiels pour faire progresser les connaissances scientifiques. EasyFlow représente un exemple de telles solutions open source et accessibles qui peuvent être facilement produites et adoptées par les laboratoires travaillant sur un large éventail de projets dans le domaine des sciences vasculaires et au-delà.

Nous rapportons que cette culture de dispositif maintient la viabilité du tissu artériel pendant au moins 7 jours et peut être utilisée pour modéliser des étapes spécifiques de la maladie vasculaire. À l’aide de cela, on pourrait modéliser les débits physiologiques et les conditions de pression13. Il est important de noter que cette culture de perfusion est rentable en raison des faibles coûts de production et du faible volume de milieu nécessaire au fonctionnement du système.

La conception 3D peut également être adaptée à de nouvelles applications et de nouveaux matériaux d’impression peuvent être testés. Même dans son format actuel, l’espace d’hébergement des échantillons peut être facilement adapté à des échantillons de différentes tailles en modifiant la longueur des raccords ou l’alésage des connecteurs Luer. Il est important de noter que, compte tenu de la nature modulaire du dispositif et de ses petites dimensions, ce bioréacteur peut être utilisé dans plusieurs configurations (Figure 5) et peut être appliqué à des cultures multiplexes, où plusieurs échantillons peuvent être exposés à différentes conditions en même temps dans des bioréacteurs séparés.

Il est envisagé d’étendre l’utilisation du système à l’avenir pour soutenir la culture de vaisseaux sanguins d’origines différentes (p. ex., différentes espèces) et de différentes natures (p. ex., veines, lymphatiques), et peut-être appliqué à la culture d’autres tissus creux (p. ex., trachée, intestin). En particulier, la recherche montre que la culture d’échafaudages d’ingénierie tissulaire en perfusion constante contribue à la distribution homogène des cellules dans la construction et la maturation du tissu résultant25,26. De plus, l’ensemencement des greffons vasculaires en perfusion contribue à l’obtention d’une lumière vasculaire plus uniformément cellularisée, par rapport aux méthodes statiques27. Pour cette raison, nous envisageons que le système soit appliqué à l’ingénierie tissulaire pour aider à relever les défis actuels, permettant le développement futur de substituts de vaisseaux sanguins synthétiques reproductibles28.

Le protocole décrit ici présente quelques étapes importantes essentielles à la réussite de la culture de flux. L’établissement et la surveillance de conditions d’écoulement appropriées ne sont pas anodins et doivent être effectués sur chaque système lors de sa première mise en place, afin de s’assurer que les conditions de culture sont physiologiques. Le débit et la pression ont été surveillés à l’aide de capteurs de pression et d’imagerie par ultrasons. Un autre point critique est de s’assurer que le tissu est viable et intact au début de la culture. Cela nécessite une source fraîche, une manipulation soigneuse et peut être vérifié par une analyse histologique. De plus, un dépannage doit être effectué au début de chaque expérience afin d’identifier toute contamination bactérienne potentielle ou toute source de fuite de fluide.

Il est important de souligner que le système de perfusion décrit, tout en fournissant des conditions physiologiques de pression et d’écoulement, n’est pas en mesure d’imiter entièrement les modèles complexes d’ondes de pression enregistrés in vivo. Cette limitation est attribuable à l’utilisation d’une pompe péristaltique et peut être résolue à l’aide d’un équipement plus spécialisé pour reproduire des conditions hémodynamiques avancées. La culture de vaisseaux sanguins dans un bioréacteur n’est pas non plus en mesure de répondre aux études où le système immunitaire ou l’interaction avec d’autres organes sont critiques.

En conclusion, un système de perfusion simple imprimé en 3D qui peut imiter l’environnement hémodynamique physiologique est présenté, ce qui devrait contribuer à la standardisation des cultures de vaisseaux sanguins ex vivo . Son potentiel de personnalisation et d’application à la culture à long terme en fait un outil essentiel pour faire progresser la compréhension de ces systèmes biologiques complexes dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le Centre de pathologie vétérinaire de l’École de médecine vétérinaire de l’Université de Surrey pour les services d’histologie. Nous remercions également les Drs L. Dixon, A. Reis et M. Henstock de l’Institut Pirbright (Pirbright, Royaume-Uni) pour leur soutien dans l’approvisionnement en tissus animaux, ainsi que le Département des sciences biochimiques de l’Université de Surrey, en particulier l’équipe technique, pour leur soutien continu. RSM a été soutenu par la bourse d’études du Doctoral College (Université de Surrey), DM et PC ont été soutenus par le Centre national pour le remplacement, le raffinement et la réduction des animaux dans la recherche (numéros de subvention : NC/R001006/1 et NC/T001216/1).

Materials

EasyFlow – – 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs
PA12 – 3D printing Protolabs – –
Peristaltic pump Heidolph  PD5201
Culture media components:
Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water Sigma-Aldrich A2942-20ML
Dextran  from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich D8802-25ML
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate Sigma-Aldrich D6429-6X500ML
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F9665
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML
Immunostaining materials:
Cryostat LEICA CM3050 S
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10ML
Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11008
Invitrogen eBioscience Fluoromount G Thermo Fisher Scientific 50-187-88
MX35 Premier + Microtome Blade Thermo Scientific 3052835
Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT Agar Scientific AGR1180
Rabbit α-CD31 antibody Abcam ab28364
Sudan Black B Santa Cruz Biotechnology SC-203760
X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box Fisher Scientific J1800AMNZ
α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody R&D Systems IC1420R
Material for laser cutting of components:
Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of  washers) RS Components 258-6590
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of  silicone seals) RS Components 840-5541
Optional pressure monitors:
Pressure sensor Parker Hannifin 080-699PSX-3P-5
SciPres Pressure Monitor Parker Hannifin 206-200-M
Pre-sterilized single use plasticware:
0.2 um filter Sarstedt 70.1114.210
20 mL Sterile syringe IMS Euro 40004
50 mL Centrifuge Tube Thermo Fisher Scientific Sarstedt – 62.547.254
Small components:
Cable ties – –
Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb Cole-Parmer WZ-30800-10 Barb Adaptor
Masterflex Polycarbonate Luer Fittings Cole-Parmer AU-45504-84
Nylon Miniature Check Valve Cole-Parmer 98553-00
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of  silicone seals) RS Components 840-5541
Stainless Steel M2 Hex Nuts RS Components 527-218
Stainless Steel M2 x 6 mm Screws RS Components 418-7426
Stainless Steel M5 Hex Nuts RS Components 189-585
Surgical vessel loop Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies  10-1003
Three-way valves IMS Euro  91000
Surgical Equipment
Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 International Medical Supplies SKU: BD-07
Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm International Medical Supplies SKU: BD-361
Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm International Medical Supplies SKU: FD-12
Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 International Medical Supplies 63114
Tubing:
Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) Eppendorf M0740-2396 System tubing
Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing ISMATEC 95714-48 Soft wall tubing (for clamp)
RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone RS Components 667-8432 Resistance tubing (small inner diameter)
Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) Heidolph 525-30027-00-0 One way valve tube
Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene RS Components 125-4042 Pump Tubing
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References

  1. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
  2. Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
  3. Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
  4. Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
  5. Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
  6. Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
  7. Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
  8. Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
  9. Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
  10. Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
  11. Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
  12. Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
  13. Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
  14. Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
  15. Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , (2017).
  16. McKeen, L. W., McKeen, L. W. Chapter 6 – Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). , 197-262 (2012).
  17. Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
  18. Ghasem, N. . Computer Methods in Chemical Engineering. , (2021).
  19. Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
  20. Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
  21. Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
  22. Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
  23. Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
  24. Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
  25. Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
  26. Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
  27. Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
  28. Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).

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Matos, R. S., Jawad, A. J., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. Ex Vivo Perfusion Culture of Large Blood Vessels in a 3D Printed Bioreactor. J. Vis. Exp. (197), e65465, doi:10.3791/65465 (2023).
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