Ex vivo Перфузионная культура крупных кровеносных сосудов в биореакторе, напечатанном на 3D-принтере
Summary
Этот протокол представляет собой настройку и работу недавно разработанного, напечатанного на 3D-принтере биореактора для культуры ex vivo кровеносных сосудов при перфузии. Система разработана таким образом, чтобы ее могли легко адаптировать другие пользователи, она практична, доступна по цене и адаптируется к различным экспериментальным приложениям, таким как фундаментальная биология и фармакологические исследования.
Abstract
Сосудистые заболевания лежат в основе большинства сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), которые остаются основной причиной смертности и заболеваемости во всем мире. Срочно необходимы эффективные хирургические и фармакологические вмешательства для профилактики и лечения сосудистых заболеваний. Отчасти нехватка трансляционных моделей ограничивает понимание клеточных и молекулярных процессов, участвующих в сосудистых заболеваниях. Биореакторы для перфузионных культур ex vivo обеспечивают идеальную платформу для изучения крупных сосудов животных (включая человека) в контролируемой динамической среде, сочетая в себе простоту культивирования in vitro и сложность живой ткани. Однако большинство биореакторов изготавливаются по индивидуальному заказу, и поэтому их трудно внедрить, что ограничивает воспроизводимость результатов. В этом документе представлена система, напечатанная на 3D-принтере, которая может быть легко изготовлена и применена в любой биологической лаборатории, а также представлен подробный протокол ее настройки, позволяющий пользователям работать. Эта инновационная и воспроизводимая система перфузионного культивирования ex vivo позволяет культивировать кровеносные сосуды до 7 дней в физиологических условиях. Мы ожидаем, что внедрение стандартизированного перфузионного биореактора будет способствовать лучшему пониманию физиологических и патологических процессов в крупных кровеносных сосудах животных и ускорит открытие новых терапевтических средств.
Introduction
Сосудистая стенка находится в реактивном устойчивом состоянии, что обеспечивает как реакцию на внешние раздражители (например, изменение давления, вазоконстрикторы), так и постоянную неактивирующую поверхность, препятствующую свертыванию крови и воспалительной клеточной инфильтрации1. В ответ на раздражители, зависящие от старения и образа жизни, а также при прямом повреждении сосудистая стенка активирует процессы ремоделирования, такие как рестеноз и атеросклероз, которые, как известно, способствуют распространенным сердечно-сосудистым заболеваниям (ССЗ), таким как ишемический инсульт и инфаркт миокарда2. Несмотря на то, что интервенционные подходы, такие как чрескожная реваскуляризация и стентирование, доступны для борьбы с распространенными проявлениями сосудистых заболеваний, они, как известно, провоцируют дальнейшее повреждение сосудов, часто приводящее к рецидиву. Кроме того, доступны лишь ограниченные профилактические и ранние решения. Понимание механизмов, поддерживающих гомеостаз сосудистой стенки и управляющих ее дисфункцией, лежит в основе разработкиновых методов лечения.
Несмотря на постоянное развитие и прогресс в области молекулярной биологии и тканевой инженерии, исследования на животных остаются важнейшим компонентом исследований сосудистой биологии. Исследования на животных in vivo дали огромное представление о механизмах сосудистого гомеостаза и патологии; Однако эти процедуры являются дорогостоящими, имеют относительно низкую пропускную способность и создают существенные этические проблемы. Кроме того, мелкие животные плохо отражают сосудистую физиологию человека, а эксперименты на более крупных животных значительно дороже и создают дополнительные этическиесоображения. В связи с растущим спросом на фармацевтические и медицинские решения для быстро стареющего населения недостатки использования животных увеличиваются, влияя на воспроизводимость, надежность и переносимость результатов для оказания медицинской помощи пациентам6.
Системы in vitro представляют собой упрощенную платформу для изучения основных механизмов, но не позволяют повторить сложность всей ткани, взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом, а также механические силы, которые являются важнейшими детерминантами в развитии сосудистыхзаболеваний.
Исследования ex vivo, проводимые на целых тканях, содержащихся в искусственно контролируемых средах, имитируют сложность in vivo, обеспечивая при этом относительно высокую производительность исследований8. Учитывая возможность тщательного контроля условий культивирования и окружающей среды, модели ex vivo позволяют проводить широкий спектр комплексных исследований и представляют собой подходящую альтернативу для сокращения использования процедур на животных в сосудистой биологии. Статические сосудистые кольцевые культуры позволили получить интересные идеи, но не смогли включить важнейший гемодинамический элемент9. Действительно, изучение сосудистой системы ex vivo ставит специфические задачи, связанные со многими динамическими силами, действующими на клетки внутри стенки кровеносного сосуда. Такие стимулы, как просветный поток, турбулентность, напряжение сдвига, давление и деформация стенок, значительно влияют на патофизиологию тканей10,11,12.
Перфузионные биореакторы необходимы для изучения сосудистого гомеостаза и ремоделирования в ответ на травму или гемодинамические изменения13. Кроме того, перфузионная культура может быть использована для улучшения созревания и долговечности тканеинженерных кровеносных сосудов (TEBV), обеспечивая подходящую альтернативу сосудистым трансплантатам14.
Коммерчески доступные перфузионные биореакторы ограничены в гибкости и адаптируемости, а также являются дорогостоящими. Многие из существующих биореакторов собственной разработки трудно воспроизвести в других лабораториях из-за ограниченного описания и отсутствия специально изготовленных компонентов 7,8,9,10,11,12. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы недавно разработали новый биореактор (EasyFlow), который экономичен в производстве, вмещает целый ряд тканей и позволяет относительно легко модифицировать его для адаптации к различным требованиям исследований13. Вкладыш напечатан на 3D-принтере и помещается как в крышку стандартной центрифужной пробирки объемом 50 мл. Его модульная конструкция и 3D-печать делают его доступным и воспроизводимым в различных лабораториях, а также легко модифицируемым для адаптации к различным научным потребностям. Этот протокол описывает сборку и базовую работу системы биореактора в условиях артериальной перфузии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Системы сосудистой перфузии ex vivo представляют собой уникальную платформу для изучения функции и поведения сосудистых клеток в их нативных тканях в контролируемых условиях, что позволяет рассекать сложные процессы, такие как посттравматическое ремоделирование сосудов22. Тем не менее, большинство биореакторов, о которых сообщалось, представляют собой системы собственного производства, основанные на компонентах, изготовленных по индивидуальному заказу, и их часто трудно воспроизвести другими компаниями23. Альтернативные коммерческие решения существуют, но им не хватает гибкости в проектировании, и они могут быть относительнодорогостоящими.
Мы разработали альтернативную систему, которая обеспечивает простую, дешевую и воспроизводимую платформу, которую можно изготовить с использованием методов 3D-печати с открытым исходным кодом13. В настоящей статье описывается настройка системы для обеспечения воспроизводимости приложений конечными пользователями. Эта установка позволяет применять физиологические и патологические условия давления (40-180 мм рт. ст.), скорости потока (6-30 мл/мин), а также в сочетании со средами, имитирующими вязкость крови, с различной степенью напряжения сдвига.
Воспроизводимость является важным аспектом научного процесса, поскольку она позволяет исследователям подтверждать результаты других исследователей и опираться на них для прогресса в понимании сосудистых заболеваний. Кроме того, инструменты, обеспечивающие и способствующие сотрудничеству между группами, имеют важнейшее значение для развития научных знаний. EasyFlow представляет собой пример таких доступных решений с открытым исходным кодом, которые могут быть легко созданы и внедрены лабораториями, работающими над широким спектром проектов в области сосудистых наук и за ее пределами.
Мы сообщаем, что этот аппаратный культиватор поддерживает жизнеспособность артериальной ткани в течение не менее 7 дней и может быть использован для моделирования конкретных стадий сосудистых заболеваний. Используя это, можно моделировать физиологические скорости потока и условия давления13. Важно отметить, что эта перфузионная культура является экономически эффективной из-за низких производственных затрат и небольшого объема среды, необходимой для работы системы.
3D-дизайн также может быть адаптирован к новым приложениям, а новые материалы для печати могут быть протестированы. Даже в нынешнем формате пространство для размещения образцов может быть легко адаптировано к образцам разных размеров, изменяя длину фитингов или отверстие соединителей Люэра. Важно отметить, что, учитывая модульный характер устройства и его небольшие габариты, этот биореактор может использоваться в нескольких установках (рис. 5) и может применяться для мультиплексных культур, где несколько образцов могут подвергаться воздействию различных условий одновременно в отдельных биореакторах.
Предполагается, что в будущем использование системы будет расширено для поддержки культивирования кровеносных сосудов различного происхождения (например, разных видов) и различной природы (например, вен, лимфатических сосудов) и, возможно, применено для культивирования других полых тканей (например, трахеи, кишечника). В частности, исследования показывают, что культивирование тканеинженерных скаффолдов в условиях постоянной перфузии способствует однородному распределению клеток внутри конструкции и созреванию полученной ткани25,26. Кроме того, посев сосудистых трансплантатов при перфузии способствует достижению более равномерно ячеистого просвета сосудов по сравнению со статическими методами27. По этой причине мы предполагаем, что система будет применяться в тканевой инженерии, чтобы помочь решить текущие проблемы, что позволит в будущем разработать воспроизводимые синтетические заменители кровеносных сосудов28.
Протокол, описанный здесь, представляет собой несколько важных шагов, имеющих решающее значение для успеха культуры потока. Установление и контроль надлежащих условий потока является нетривиальной задачей и должно выполняться на каждой системе при ее первой настройке, чтобы убедиться, что условия культивирования являются физиологическими. Расход и давление контролировались с помощью датчиков давления и ультразвуковой визуализации. Еще одним важным моментом является обеспечение жизнеспособности и неповрежденности ткани в начале культивирования. Это требует свежего источника, осторожного обращения и может быть подтверждено гистологическим анализом. Кроме того, в начале каждого эксперимента необходимо выполнять поиск и устранение неисправностей для выявления любого потенциального бактериального загрязнения или источника утечки среды.
Важно подчеркнуть, что описанная перфузионная система, обеспечивая физиологические условия давления и потока, не может полностью имитировать сложные паттерны волн давления, зарегистрированные in vivo. Это ограничение связано с использованием перистальтического насоса и может быть устранено с помощью более специализированного оборудования для воспроизведения сложных гемодинамических состояний. Культивирование кровеносных сосудов в биореакторе также не может быть использовано в исследованиях, где иммунная система или взаимодействие с другими органами имеют решающее значение.
В заключение представлена простая напечатанная на 3D-принтере перфузионная система, которая может имитировать физиологическую гемодинамическую среду, которая, как ожидается, будет способствовать стандартизации культур кровеносных сосудов ex vivo . Его потенциал для адаптации и применения в долговременной культуре делает его важным инструментом для углубления понимания этих сложных биологических систем в физиологии и патологических состояниях.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Центру ветеринарной патологии Школы ветеринарной медицины Университета Суррея за услуги по гистологии. Мы также благодарим докторов Л. Диксона, А. Рейса и М. Хенстока из Института Пирбрайта (Пирбрайт, Великобритания) за их поддержку в приобретении тканей животных, а также Департамент биохимических наук Университета Суррея, особенно техническую команду, за их постоянную поддержку. RSM был поддержан студенческой премией Doctoral College (Университет Суррея), DM и PC были поддержаны Национальным центром по замене, уточнению и сокращению животных в исследованиях (номера грантов: NC/R001006/1 и NC/T001216/1).
Materials
| EasyFlow | – | – | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 – 3D printing | Protolabs | – | – |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt – 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | – | – | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795 (2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742 (2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580 (2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , (2017).
- McKeen, L. W., McKeen, L. W. Chapter 6 – Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). , 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. . Computer Methods in Chemical Engineering. , (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275 (2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565 (2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214 (2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499 (2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
