Ex Vivo Perfusionskultur großer Blutgefäße in einem 3D-gedruckten Bioreaktor
Summary
Dieses Protokoll stellt den Aufbau und Betrieb eines neu entwickelten, 3D-gedruckten Bioreaktors für die ex vivo Kultur von Blutgefäßen in Perfusion vor. Das System ist so konzipiert, dass es leicht von anderen Benutzern übernommen werden kann, praktisch, erschwinglich und an verschiedene experimentelle Anwendungen wie grundlegende biologische und pharmakologische Studien anpassbar ist.
Abstract
Gefäßerkrankungen bilden die Grundlage für die meisten Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs), die nach wie vor weltweit die Hauptursache für Mortalität und Morbidität sind. Wirksame chirurgische und pharmakologische Eingriffe zur Vorbeugung und Behandlung von Gefäßerkrankungen sind dringend erforderlich. Zum Teil schränkt der Mangel an translationalen Modellen das Verständnis der zellulären und molekularen Prozesse ein, die an Gefäßerkrankungen beteiligt sind. Ex-vivo-Perfusionskultur-Bioreaktoren bieten eine ideale Plattform für die Untersuchung großer Tiergefäße (einschließlich Menschen) in einer kontrollierten dynamischen Umgebung, die die Leichtigkeit der In-vitro-Kultur und die Komplexität des lebenden Gewebes kombiniert. Die meisten Bioreaktoren sind jedoch kundenspezifisch gefertigt und daher schwer zu übernehmen, was die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse einschränkt. In diesem Artikel wird ein 3D-gedrucktes System vorgestellt, das leicht hergestellt und in jedem biologischen Labor angewendet werden kann, und es wird ein detailliertes Protokoll für seine Einrichtung bereitgestellt, das den Benutzern den Betrieb ermöglicht. Dieses innovative und reproduzierbareEx-vivo-Perfusionskultursystem ermöglicht die Kultivierung von Blutgefäßen für bis zu 7 Tage unter physiologischen Bedingungen. Wir gehen davon aus, dass die Einführung eines standardisierten Perfusionsbioreaktors zu einem besseren Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse in den Blutgefäßen großer Tiere beitragen und die Entdeckung neuer Therapeutika beschleunigen wird.
Introduction
Die Gefäßwand befindet sich in einem reaktiven stationären Zustand, der sowohl die Empfindlichkeit gegenüber äußeren Reizen (d. h. Druckänderungen, Vasokonstriktoren) als auch eine konsistente, nicht aktivierende Oberfläche gewährleistet, die die Blutgerinnung und die Infiltration von Entzündungszellen verhindert1. Als Reaktion auf alters- und lebensstilabhängige Reize und bei direkter Schädigung aktiviert die Gefäßwand Umbauprozesse wie Restenose und Atherosklerose, die bekanntermaßen zu häufigen kardiovaskulären Erkrankungen wie ischämischem Schlaganfall und Myokardinfarkt beitragen2. Während interventionelle Ansätze wie perkutane Revaskularisation und Stentimplantation zur Behandlung fortgeschrittener Manifestationen von Gefäßerkrankungen zur Verfügung stehen, ist bekannt, dass diese weitere Gefäßschäden hervorrufen, die oft zu einem Rezidiv führen. Darüber hinaus gibt es nur begrenzte präventive und frühzeitige Lösungen. Das Verständnis der Mechanismen, die die Homöostase der Gefäßwand aufrechterhalten und ihre Dysfunktion vorantreiben, steht im Mittelpunkt der Entwicklung neuer Heilmittel3.
Trotz der ständigen Entwicklung und der Fortschritte in der Molekularbiologie und dem Tissue Engineering bleiben Tierversuche ein entscheidender Bestandteil der gefäßbiologischen Studien. In-vivo-Tierstudien haben enorme Einblicke in die Mechanismen der vaskulären Homöostase und Pathologie geliefert. Diese Verfahren sind jedoch kostspielig, haben einen relativ geringen Durchsatz und werfen erhebliche ethische Fragen auf. Darüber hinaus sind Kleintiere für die menschliche Gefäßphysiologie nur unzureichend repräsentativ, und größere Tierversuche sind erheblich teurer und werfen weitere ethische Überlegungen auf 4,5. Mit der steigenden Nachfrage nach pharmazeutischen und medizinischen Lösungen für eine schnell alternde Bevölkerung werden die Nachteile der Verwendung von Tieren verstärkt, was sich auf die Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Patientenversorgung auswirkt6.
In-vitro-Systeme bieten eine vereinfachte Plattform zur Untersuchung grundlegender Mechanismen, können aber nicht die Komplexität des gesamten Gewebes, die Wechselwirkungen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix sowie die mechanischen Kräfte rekapitulieren, die entscheidende Determinanten bei der Entwicklung von Gefäßerkrankungen sind7.
Ex-vivo-Studien, die an ganzen Geweben durchgeführt wurden, die in künstlich kontrollierten Umgebungen gehalten wurden, ahmen die In-vivo-Komplexität nachund ermöglichen gleichzeitig Untersuchungen mit relativ hohem Durchsatz 8. Aufgrund der Fähigkeit, die Kulturbedingungen und die Umgebung genau zu kontrollieren, ermöglichen Ex-vivo-Modelle ein breites Spektrum komplexer Studien und bieten eine geeignete Alternative, um den Einsatz von tierischen Verfahren in der Gefäßbiologie zu reduzieren. Statische vaskuläre Ringkulturen boten interessante Einblicke, konnten aber das entscheidende hämodynamische Element9 nicht integrieren. In der Tat stellt die Untersuchung des Gefäßsystems ex vivo besondere Herausforderungen dar, die mit den vielen dynamischen Kräften zusammenhängen, die auf die Zellen innerhalb der Blutgefäßwand wirken. Stimuli wie luminale Strömung, Turbulenz, Scherspannung, Druck und Wandverformung haben einen signifikanten Einfluss auf die Pathophysiologie des Gewebes10,11,12.
Perfusionsbioreaktoren sind unerlässlich für die Untersuchung der vaskulären Homöostase und des Umbaus als Reaktion auf Verletzungen oder hämodynamische Veränderungen13. Darüber hinaus kann die Perfusionskultur verwendet werden, um die Reifung und Haltbarkeit von Tissue-Engineering-Blutgefäßen (TEBVs) zu verbessern und geeignete Alternativen für Gefäßtransplantate zu bieten14.
Kommerziell erhältliche Perfusionsbioreaktoren sind in ihrer Flexibilität und Anpassungsfähigkeit eingeschränkt und kostspielig. Viele der existierenden, intern entwickelten Bioreaktoren sind jedoch aufgrund der begrenzten Beschreibungen und der Nichtverfügbarkeit speziell angefertigter Komponenten 7,8,9,10,11,12 nur schwer in anderen Labors zu replizieren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir kürzlich einen neuen Bioreaktor (EasyFlow) entwickelt, der wirtschaftlich herzustellen ist, eine Reihe von Geweben aufnehmen kann und relativ einfache Modifikationen ermöglicht, um sich an unterschiedliche Forschungsanforderungen anzupassen13. Der Einsatz ist 3D-gedruckt und passt wie in einen Deckel eines Standard-50-ml-Zentrifugenröhrchens. Sein modularer Aufbau und die 3D-Druckfertigung machen es in verschiedenen Labors zugänglich und reproduzierbar sowie leicht modifizierbar, um sich an unterschiedliche wissenschaftliche Anforderungen anzupassen. Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und den grundlegenden Betrieb des Bioreaktorsystems in einer arteriellen Perfusionsumgebung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex-vivo-Gefäßperfusionssysteme stellen eine einzigartige Plattform dar, um die Funktion und das Verhalten von Gefäßzellen in ihren natürlichen Geweben unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen, was die Analyse komplexer Prozesse wie des Gefäßumbaus nach Verletzungen ermöglicht22. Bei den meisten Bioreaktoren handelt es sich jedoch um intern hergestellte Systeme, die auf maßgeschneiderten Komponenten basieren und oft nur schwer von anderen repliziert werdenkönnen 23. Es gibt alternative kommerzielle Lösungen, aber es fehlt ihnen an Flexibilität in der Gestaltung und sie können relativ kostspielig sein24.
Wir haben ein alternatives System entwickelt, das eine einfache, kostengünstige und reproduzierbare Plattform bietet, die mit Open-Source-3D-Drucktechniken hergestellt werden kann13. Der vorliegende Artikel beschreibt den Aufbau des Systems, um reproduzierbare Anwendungen durch Endbenutzer zu ermöglichen. Dieser Aufbau ermöglicht die Anwendung physiologischer und pathologischer Bedingungen wie Druck (40-180 mmHg), Flussrate (6-30 ml/min) und in Kombination mit Medien, die die Blutviskosität nachahmen, mit unterschiedlichen Scherspannungen.
Die Reproduzierbarkeit ist ein wesentlicher Aspekt des wissenschaftlichen Prozesses, da sie es den Forschern ermöglicht, die Ergebnisse anderer zu validieren und darauf aufzubauen, um unser Verständnis von Gefäßerkrankungen zu verbessern. Darüber hinaus sind Werkzeuge, die die Zusammenarbeit zwischen Gruppen ermöglichen und fördern, für den Fortschritt wissenschaftlicher Erkenntnisse unerlässlich. EasyFlow ist ein Beispiel für solche zugänglichen Open-Source-Lösungen, die von Laboren, die an einer Vielzahl von Projekten im Bereich der Gefäßwissenschaften und darüber hinaus arbeiten, leicht erstellt und übernommen werden können.
Wir berichten, dass diese Gerätekultur die Lebensfähigkeit des arteriellen Gewebes für mindestens 7 Tage aufrechterhält und verwendet werden kann, um bestimmte Schritte von Gefäßerkrankungen zu modellieren. Damit ließen sich physiologische Flussraten und Druckverhältnisse modellieren13. Wichtig ist, dass diese Perfusionskultur aufgrund der niedrigen Produktionskosten und der geringen Menge an Medium, die für den Betrieb des Systems erforderlich ist, kostengünstig ist.
Das 3D-Design kann auch an neue Anwendungen angepasst und neue Materialien für den Druck getestet werden. Auch im aktuellen Format kann der Probenraum leicht an Proben unterschiedlicher Größe angepasst werden, indem die Länge der Anschlüsse oder die Bohrung der Luer-Konnektoren geändert wird. Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Bioreaktor aufgrund des modularen Charakters des Geräts und seiner geringen Abmessungen in mehreren Aufbauten verwendet werden kann (Abbildung 5) und auf Multiplexkulturen angewendet werden kann, bei denen mehrere Proben gleichzeitig in separaten Bioreaktoren unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt werden können.
Es ist vorgesehen, die Verwendung des Systems in Zukunft auszuweiten, um die Kultur von Blutgefäßen unterschiedlichen Ursprungs (z. B. verschiedene Spezies) und unterschiedlicher Art (z. B. Venen, Lymphgefäße) zu unterstützen und möglicherweise auf die Kultur anderer Hohlgewebe (z. B. Luftröhre, Darm) anzuwenden. Insbesondere zeigt die Forschung, dass die Kultivierung von Tissue-Engineering-Scaffolds in konstanter Perfusion die homogene Verteilung von Zellen innerhalb des Konstrukts und die Reifung des resultierenden Gewebes unterstützt25,26. Darüber hinaus trägt die Aussaat von Gefäßtransplantaten in Perfusion dazu bei, im Vergleich zu statischen Methoden ein gleichmäßigeres zellularisiertes Gefäßlumen zu erreichen27. Aus diesem Grund stellen wir uns vor, dass das System auf das Tissue Engineering angewendet wird, um die aktuellen Herausforderungen zu bewältigen und die zukünftige Entwicklung reproduzierbarer synthetischer Blutgefäßersatzstoffe zu ermöglichen28.
Das hier beschriebene Protokoll stellt einige wichtige Schritte vor, die für den Erfolg der Flow-Kultur entscheidend sind. Die Festlegung und Überwachung geeigneter Strömungsbedingungen ist nicht trivial und muss bei der erstmaligen Einrichtung jedes Systems durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Kulturbedingungen physiologisch sind. Der Durchfluss und der Druck wurden mit Hilfe von Drucksensoren und Ultraschall überwacht. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Sicherstellung, dass das Gewebe zu Beginn der Kultur lebensfähig und intakt ist. Dies erfordert eine frische Quelle, einen sorgfältigen Umgang und kann durch eine histologische Analyse nachgewiesen werden. Darüber hinaus muss zu Beginn jedes Experiments eine Fehlersuche durchgeführt werden, um potenzielle bakterielle Kontaminationen oder Medienleckquellen zu identifizieren.
Es ist wichtig hervorzuheben, dass das beschriebene Perfusionssystem zwar physiologische Druck- und Strömungsbedingungen liefert, aber nicht in der Lage ist, die komplexen Druckwellenmuster, die in vivo aufgezeichnet werden, vollständig nachzuahmen. Diese Einschränkung ist auf die Verwendung einer Peristaltikpumpe zurückzuführen und kann mit spezialisierteren Geräten zur Reproduktion fortgeschrittener hämodynamischer Bedingungen behoben werden. Die Kultur von Blutgefäßen in einem Bioreaktor ist auch nicht in der Lage, Studien zu behandeln, bei denen das Immunsystem oder die Interaktion mit anderen Organen entscheidend ist.
Abschließend wird ein einfaches 3D-gedrucktes Perfusionssystem vorgestellt, das die physiologische hämodynamische Umgebung nachahmen kann, von dem erwartet wird, dass es zur Standardisierung von ex vivo Blutgefäßkulturen beiträgt. Sein Potenzial für die Anpassung und Anwendung auf Langzeitkulturen macht es zu einem unverzichtbaren Werkzeug, um das Verständnis dieser komplexen biologischen Systeme in physiologischer und pathologischer Hinsicht zu verbessern.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Veterinary Pathology Centre der University of Surrey School of Veterinary Medicine für die histologischen Dienstleistungen. Wir danken auch Dr. L. Dixon, Dr. A. Reis und Dr. M. Henstock vom Pirbright Institute (Pirbright, UK) für ihre Unterstützung bei der Beschaffung der tierischen Gewebe und dem Department of Biochemical Sciences der University of Surrey, insbesondere dem technischen Team, für ihre anhaltende Unterstützung. RSM wurde durch den Doctoral College Studentship Award (University of Surrey) unterstützt, DM und PC wurden vom National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research unterstützt (Fördernummern: NC/R001006/1 und NC/T001216/1).
Materials
| EasyFlow | – | – | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 – 3D printing | Protolabs | – | – |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt – 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | – | – | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
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