Bu protokol, perfüzyonda kan damarlarının ex vivo kültürü için yeni geliştirilen, 3D baskılı bir biyoreaktörün kurulumunu ve çalıştırılmasını sunar. Sistem, diğer kullanıcılar tarafından kolayca benimsenebilecek, pratik, uygun fiyatlı ve temel biyoloji ve farmakolojik çalışmalar gibi farklı deneysel uygulamalara uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.
Vasküler hastalıklar, tüm dünyada mortalite ve morbiditenin birincil nedeni olmaya devam eden çoğu kardiyovasküler hastalığın (KVH) temelini oluşturur. Vasküler hastalıkları önlemek ve tedavi etmek için etkili cerrahi ve farmakolojik müdahalelere acilen ihtiyaç vardır. Kısmen, translasyonel modellerin eksikliği, vasküler hastalıkta yer alan hücresel ve moleküler süreçlerin anlaşılmasını sınırlamaktadır. Ex vivo perfüzyon kültürü biyoreaktörleri, in vitro kültürün kolaylığını ve canlı dokunun karmaşıklığını birleştirerek, kontrollü dinamik bir ortamda büyük hayvan damarlarının (insanlar dahil) incelenmesi için ideal bir platform sağlar. Bununla birlikte, çoğu biyoreaktör özel olarak üretilir ve bu nedenle sonuçların tekrarlanabilirliğini sınırlayarak benimsenmesi zordur. Bu makale, herhangi bir biyolojik laboratuvarda kolayca üretilebilen ve uygulanabilen 3D baskılı bir sistem sunar ve kurulumu için ayrıntılı bir protokol sağlayarak kullanıcıların çalışmasını sağlar. Bu yenilikçi ve tekrarlanabilir ex vivo perfüzyon kültür sistemi, fizyolojik koşullarda 7 güne kadar kan damarlarının kültürlenmesini sağlar. Standartlaştırılmış bir perfüzyon biyoreaktörünün benimsenmesinin, büyük hayvan kan damarlarındaki fizyolojik ve patolojik süreçlerin daha iyi anlaşılmasını destekleyeceğini ve yeni terapötiklerin keşfini hızlandıracağını umuyoruz.
Vasküler duvar, hem dış uyaranlara (yani basınç değişikliği, vazokonstriktörler) hem de kan pıhtılaşmasını ve enflamatuar hücre infiltrasyonunu önleyen tutarlı bir aktive olmayan yüzey sağlayan reaktif sabit bir durumda bulunur1. Yaşlanmaya ve yaşam tarzına bağlı uyaranlara yanıt olarak ve doğrudan hasar üzerine vasküler duvar, iskemik inme ve miyokard enfarktüsü gibi yaygın kardiyovasküler hastalıklara (KVH’ler) katkıda bulunduğu bilinen restenoz ve ateroskleroz gibi yeniden şekillenme süreçlerini aktive eder2. Vasküler hastalığın ilerlemiş bulgularının üstesinden gelmek için perkütan revaskülarizasyon ve stentleme gibi girişimsel yaklaşımlar mevcut olsa da, bunların daha fazla vasküler hasara neden olduğu ve sıklıkla nükslere yol açtığı bilinmektedir. Ek olarak, yalnızca sınırlı önleyici ve erken aşama çözümler mevcuttur. Vasküler duvar homeostazını sürdüren ve işlev bozukluğunu yönlendiren mekanizmaları anlamak, yeni tedaviler geliştirmenin merkezinde yer alır3.
Moleküler biyoloji ve doku mühendisliğindeki sürekli gelişme ve ilerlemelere rağmen, hayvan çalışmaları vasküler biyoloji çalışmalarının çok önemli bir bileşeni olmaya devam etmektedir. İn vivo hayvan çalışmaları, vasküler homeostaz ve patoloji mekanizmaları hakkında muazzam bir fikir vermiştir; Bununla birlikte, bu prosedürler maliyetlidir, nispeten düşük verime sahiptir ve önemli etik sorunlar ortaya çıkarır. Ek olarak, küçük hayvanlar insan vasküler fizyolojisini zayıf bir şekilde temsil eder ve daha büyük hayvan deneyleri çok daha pahalıdır ve daha fazla etik husus yaratır 4,5. Hızla yaşlanan bir nüfus için farmasötik ve tıbbi çözümlere yönelik artan taleple birlikte, hayvan kullanımının olumsuz yönleri büyütülmekte ve sonuçların tekrarlanabilirliğini, güvenilirliğini ve hasta bakımına aktarılabilirliğini etkilemektedir6.
İn vitro sistemler, temel mekanizmaları incelemek için basitleştirilmiş bir platform sunar, ancak tüm dokunun karmaşıklığını, hücreler ve hücre dışı matris arasındaki etkileşimleri ve vasküler hastalıkların gelişiminde kritik belirleyiciler olan mekanik kuvvetleri özetlemekte başarısız olur7.
Yapay olarak kontrol edilen ortamlarda tutulan tüm dokular üzerinde gerçekleştirilen ex vivo çalışmalar, nispeten yüksek verimli araştırmalara olanak tanırken in vivo karmaşıklığı taklit eder8. Kültür koşullarını ve çevreyi yakından kontrol etme yeteneği göz önüne alındığında, ex vivo modeller çok çeşitli karmaşık çalışmalara izin verir ve vasküler biyolojide hayvan prosedürlerinin kullanımını azaltmak için uygun bir alternatif sunar. Statik vasküler halka kültürleri ilginç bilgiler sundu, ancak önemli hemodinamik unsuru dahil etmede başarısızoldu 9. Gerçekten de, vasküler sistemin ex vivo çalışması, kan damarı duvarındaki hücrelere uygulanan birçok dinamik kuvvetle ilgili belirli zorluklar ortaya koymaktadır. Luminal akış, türbülans, kayma gerilmesi, basınç ve duvar deformasyonu gibi uyaranlar doku patofizyolojisini önemli ölçüde etkiler10,11,12.
Perfüzyon biyoreaktörleri, yaralanma veya hemodinamik değişikliklere yanıt olarak vasküler homeostazı ve yeniden şekillenmeyi incelemek için gereklidir13. Ayrıca, perfüzyon kültürü, doku mühendisliği kan damarlarının (TEBV’ler) olgunlaşmasını ve dayanıklılığını artırmak için kullanılabilir ve vasküler greftler için uygun alternatifler sağlar14.
Ticari olarak temin edilebilen perfüzyon biyoreaktörleri esneklik ve uyarlanabilirlik açısından sınırlıdır ve maliyetlidir. Mevcut şirket içinde geliştirilen biyoreaktörlerin çoğunun, sınırlı açıklamalar ve özel olarak yapılmışbileşenlerin 7,8,9,10,11,12 bulunmaması nedeniyle diğer laboratuvarlarda çoğaltılması zordur. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, yakın zamanda üretimi ekonomik olan, bir dizi dokuyu barındıran ve farklı araştırma taleplerine uyum sağlamak için nispeten basit modifikasyonlara olanak tanıyan yeni bir biyoreaktör (EasyFlow) geliştirdik13. Ek parça 3D baskılıdır ve standart 50 mL santrifüj tüpünün kapağına oturur. Modüler tasarımı ve 3D baskı üretimi, farklı laboratuvarlarda erişilebilir ve tekrarlanabilir olmasının yanı sıra farklı bilimsel ihtiyaçlara uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir olmasını sağlar. Bu protokol, biyoreaktör sisteminin bir arteriyel perfüzyon ortamında montajını ve temel çalışmasını açıklar.
Ex vivo vasküler perfüzyon sistemleri, kontrollü koşullar altında doğal dokularındaki vasküler hücrelerin işlev ve davranışlarını incelemek için benzersiz bir platform oluşturur ve bu da yaralanma sonrası vasküler yeniden şekillenme gibi karmaşık süreçlerin diseksiyonunu sağlar22. Bununla birlikte, rapor edilen biyoreaktörlerin çoğu, ısmarlama bileşenlere dayalı şirket içi sistemlerdir ve genellikle başkaları tarafından kopyalanması zordur23. Alternatif ticari çözümler mevcuttur, ancak tasarımda esneklikten yoksundur ve nispeten maliyetli olabilir24.
Açık kaynaklı 3D baskı teknikleri kullanılarak üretilebilen kolay, ucuz ve tekrarlanabilir bir platform sağlayan alternatif bir sistem geliştirdik13. Bu makalede, son kullanıcılar tarafından tekrarlanabilir uygulamaları etkinleştirmek için sistemin kurulumu açıklanmaktadır. Bu kurulum, fizyolojik ve patolojik basınç (40-180 mmHg), akış hızı (6-30 mL/dak) koşullarının ve değişen derecelerde kayma gerilimi ile kan viskozitesini taklit eden ortamla kombinasyon halinde uygulanmasını sağlar.
Tekrarlanabilirlik, araştırmacıların başkalarının bulgularını doğrulamasına ve vasküler hastalıklar hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için bunları geliştirmesine izin verdiği için bilimsel sürecin önemli bir yönüdür. Ayrıca, gruplar arasında işbirliğini mümkün kılan ve teşvik eden araçlar, bilimsel bilgiyi ilerletmek için gereklidir. EasyFlow, vasküler bilimler alanında ve ötesinde çok çeşitli projeler üzerinde çalışan laboratuvarlar tarafından kolayca üretilebilen ve benimsenebilen bu tür açık kaynaklı, erişilebilir çözümlerin bir örneğini temsil eder.
Bu cihaz kültürünün en az 7 gün boyunca arteriyel doku canlılığını koruduğunu ve vasküler hastalığın belirli basamaklarını modellemek için kullanılabileceğini bildiriyoruz. Bunu kullanarak, fizyolojik akış hızları ve basınç koşullarımodellenebilir 13. Daha da önemlisi, bu perfüzyon kültürü, düşük üretim maliyetleri ve sistemi çalıştırmak için gerekli olan düşük ortam hacmi nedeniyle uygun maliyetlidir.
3D tasarım ayrıca yeni uygulamalara uyarlanabilir ve baskı için yeni malzemeler test edilebilir. Mevcut formatında bile, numune yerleştirme alanı, bağlantı parçalarının uzunluğu veya luer konektörlerinin deliği değiştirilerek farklı boyutlardaki numunelere kolayca uyarlanabilir. Cihazın modüler yapısı ve küçük boyutları göz önüne alındığında, bu biyoreaktörün birkaç kurulumda kullanılabileceğini (Şekil 5) ve birkaç numunenin aynı anda farklı koşullara maruz bırakılabileceği multipleks kültürlere uygulanabileceğini belirtmek önemlidir.
Sistemin kullanımının, farklı kökenlerden (örneğin, farklı türler) ve farklı doğalardan (örneğin, damarlar, lenfatik) kan damarlarının kültürünü desteklemek için gelecekte genişletilmesi ve belki de diğer içi boş dokuların (örneğin, trakea, bağırsak) kültürüne uygulanması öngörülmektedir. Özellikle, araştırmalar, doku mühendisliği iskelelerinin sürekli perfüzyonda kültürlenmesinin, hücrelerin yapı içinde homojen dağılımına ve elde edilen dokunun olgunlaşmasına yardımcı olduğunu göstermektedir25,26. Ek olarak, vasküler greftlerin perfüzyonda ekilmesi, statik yöntemlere kıyasla daha düzgün bir hücreselleştirilmiş vasküler lümen elde edilmesine katkıda bulunur27. Bu nedenle, sistemin mevcut zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı olmak için doku mühendisliğine uygulanmasını ve tekrarlanabilir sentetik kan damarı ikamelerinin gelecekte geliştirilmesine izin vermesini öngörüyoruz28.
Burada açıklanan protokol, akış kültürünün başarısı için kritik olan bazı önemli adımları sunar. Uygun akış koşullarının oluşturulması ve izlenmesi önemsiz değildir ve kültür koşullarının fizyolojik olduğundan emin olmak için ilk kez kurulduğunda her sistemde gerçekleştirilmesi gerekir. Akış ve basınç, basınç sensörleri ve ultrason görüntüleme kullanılarak izlendi. Bir diğer kritik nokta ise kültürün başlangıcında dokunun canlı ve sağlam olmasını sağlamaktır. Bu, yeni bir kaynak, dikkatli kullanım gerektirir ve histolojik analizle doğrulanabilir. Ek olarak, herhangi bir potansiyel bakteriyel kontaminasyonu veya ortam sızıntısı kaynağını belirlemek için her deneyin başında sorun giderme yapılmalıdır.
Açıklanan perfüzyon sisteminin, fizyolojik basınç ve akış koşulları sağlarken, in vivo olarak kaydedilen karmaşık basınç dalgası modellerini tamamen taklit edemediğini vurgulamak önemlidir. Bu sınırlama, peristaltik bir pompa kullanımına atfedilebilir ve ileri hemodinamik koşulları yeniden üretmek için daha özel ekipman kullanılarak çözülebilir. Bir biyoreaktördeki kan damarlarının kültürü, bağışıklık sisteminin veya diğer organlarla etkileşimin kritik olduğu çalışmaları da ele alamaz.
Sonuç olarak, ex vivo kan damarı kültürlerinin standardizasyonuna katkıda bulunması beklenen, fizyolojik hemodinamik ortamı taklit edebilen basit bir 3D baskılı perfüzyon sistemi sunulmuştur. Özelleştirme ve uzun vadeli kültüre uygulama potansiyeli, onu fizyoloji ve patolojik koşullarda bu karmaşık biyolojik sistemlerin anlaşılmasını ilerletmek için önemli bir araç haline getirir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, histoloji hizmetleri için Surrey Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi’ndeki Veteriner Patoloji Merkezi’ne teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Pirbright Enstitüsü’nden (Pirbright, İngiltere) Dr. L. Dixon, A. Reis ve M. Henstock’a hayvan dokularının teminindeki destekleri için ve Surrey Üniversitesi Biyokimyasal Bilimler Bölümü’ne, özellikle de teknik ekibe sürekli destekleri için teşekkür ederiz. RSM, Doktora Koleji öğrenci ödülü (Surrey Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir, DM ve PC, Araştırmada Hayvanların Değiştirilmesi, İyileştirilmesi ve Azaltılması Ulusal Merkezi tarafından desteklenmiştir (hibe numaraları: NC / R001006 / 1 ve NC / T001216 / 1).
EasyFlow | – | – | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
PA12 – 3D printing | Protolabs | – | – |
Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
Culture media components: | |||
Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
Immunostaining materials: | |||
Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
Material for laser cutting of components: | |||
Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
Optional pressure monitors: | |||
Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
Pre-sterilized single use plasticware: | |||
0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt – 62.547.254 | |
Small components: | |||
Cable ties | – | – | |
Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
Surgical Equipment | |||
Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
Tubing: | |||
Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |