Ex Vivo(エクス・ビボ )3Dプリントされたバイオリアクターでの大血管の灌流培養

このプロトコルでは、2つのEasyFlow(バイオリアクター)インサートで構成されるシステムの組み立てと使用について説明します:1つは灌流動脈サンプルを含む反応チャンバー(C)を表し、1つは媒体リザーバー(R)として機能します(図1 および 図2A)。頸動脈は、英国のピルブライト研究所で生後4〜6週齢の雄と雌の子豚(6〜12 kg)から採取されました。動物の処置は、1986年内務省動物(科学的手順)法(ASPA)に基づいて実施され、ピルブライト研究所の動物福祉倫理審査委員会(AWERB)によって承認されました。動物は、飼育された動物の飼育とケアに関する行動規範に従って収容されました。すべての手続きは、プロジェクトライセンスPPL70/8852の下で訓練を受け、有能な個人ライセンス所有者によって実施されました。子豚は、ASPAの下でスケジュール1の方法に従って淘汰されました。 1. インサート製造 付属の3Dモデル(補足ファイル1)を使用して、3Dプリントでインサートを製造します。注:3Dモデリングにより、新しいアプリケーションに適応するために設計を簡単に変更できます。代替材料および代替製造技術を使用して、インサートを製造することもできます。内部構造が複雑なため、選択的レーザー焼結と光造形が適切な代替手段である15。ポリアミド12(PA12;材料表を参照)は、液体保持と繰り返しの加熱滅菌サイクルに対する耐性の点で優れた性能を発揮するため、優れた 材料候補です16。 シリコンガスケットとポリカーボネートワッシャーを、補足ファイル2に提供された設計を使用して、レーザー切断17によって製造する。注:レーザー切断は簡単に外注でき、安価な製造方法です。ワッシャーはステンレス鋼で製造できるため、繰り返し使用するためのより耐性のあるコンポーネントを提供します。その他の部品は全て市販品です。必要な材料の完全なリストを 表1に示します。品目の商業的な詳細は、 材料表に含まれています。 2. デバイスの滅菌、組み立て、プライミング 表1の指示に従ってすべてのコンポーネントを滅菌します。 層流条件下で、 図1Aに示すように、2つの製造インサートを組み立てます(ステップ1)。 以下の手順に従って、 図2のように灌流システムを組み立てます。接続された2つの三方弁をリザーバーのR1ポート(メディア交換ポート)に取り付けます。 得られた出口を、一方向弁(一方向弁管)を備えたチューブを使用して、蠕動ポンプのヘッドに接続します。 ポンプヘッドを反応チャンバーのC4ポートに、一方向バルブを備えたシステムチューブで接続します。注意: このブランチには、オプションで圧力センサーを装備して、常時監視することができます。 反応チャンバーポートC1を軟壁チューブに接続し、これを抵抗チャネル(内径の小さい)に接続します。注意: 抵抗チューブの長さは、システム内に存在する圧力に大きく影響します。これは、適切な ?? 流条件を確保するためにさらに調査する必要があります。. システムチューブで抵抗チャネルを拡張し、リターンチャネルを作成し、R5でリザーバーに接続して管腔循環ループを閉じます(図2C)。 反応チャンバーC3をシステムチューブでリザーバーR3に接続してオーバーフローチャネルを作成します。 R2に通気フィルターを取り付けます。 空気と媒体の入ったシリンジを反応室C6に接続して圧力減衰器を作成する。注意: 正しい空気対媒体の比率は、必要な圧力減衰によって異なります。 培地交換ポートとリザーバーを介して、灌流培地(ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM] + 10% [v/v]ウシ胎児血清[FBS] + 1% [v/v]ペニシリン-ストレプトマイシン + 1% [v/v]アムホテリシンB + 30% [v/v]デキストラン; 材料表を参照)でシステムをプライムします。メモ: システムを呼び水処理すると、システムに気泡が閉じ込められるリスクが軽減され、漏れの可能性が特定されます。培地の推奨量は約100〜120mLです。使用される容量は、実験に使用するチューブのデッドボリュームによって異なります。 3. サンプルの採取と調製 左右の総頸動脈を採取し、動脈組織の直接的な取り扱いを最小限にする13。 組織を冷間輸送培地(DMEM + 20% [v/v] FBS + 2% [v/v]ペニシリン-ストレプトマイシン + 1% [v/v]アムホテリシンB、 材料表を参照)に入れて転写します。 層流キャビネットでは、余分な結合組織を取り除き、メスの刃を使用して組織の端を切り取ります。組織を低温輸送媒体で2回洗浄します。 組織を輸送媒体中のオービタルシェーカーに少なくとも30分間置き、完全に洗浄します。 2つの有刺鉄線ルアーコネクタを使用して動脈の非分岐セグメントをバイオリアクターシステムに接続し、血管ボンド(血管シリコンタイ; 表1)。注意: ベッセルボンドは、ベッセルを固定するための適切な張力と収縮を提供します。楕円形の部分は、組織の損傷を防ぎます。 動脈に培地を静かに流し、開存性を確認します。 作製したインサートに動脈を固定した後、反応空間を灌流培地で満たします(ステップ2.4)。最後に、管腔循環ループを媒体で静かに満たして、システムから残っている空気を取り除きます。 反応空間を以前に組み立てた灌流システム(セクション2)に接続し、循環を完了します。注:処理された組織の免疫組織化学による品質チェックを実行することをお勧めします。これにより、準備中の過度の取り扱いによる損傷が特定されます。 4. 灌流培養と培地の変化 灌流システムを 5% CO2 を含む 37 °C のインキュベーターに入れ、蠕動ポンプに接続します ( 材料表を参照) 圧力センサーなどの追加の(通性)取得システムを接続します( 材料表を参照)。 システムを一晩放置し、10~15 mL/minの低い培地流量で平衡化します。注意: ポンプの設定、媒体の流れ、システム圧力、および最適な圧力ダンパー/クランプの設定を決定するための最初の実験は、適切な条件が満たされていることを確認するために必要です。 翌日、最終流量(35 mL/分)に達するまで、流量を段階的に増やします(+1 rpm/1 rpm、現在のシステムでは1時間あたり~2.5 mL/分の増加に相当)。システムに漏れがないか定期的に監視します。注意: 蠕動ポンプ速度に基づいて正確な流量を計算するには、ユーザーは最初に適切なポンプ校正18を実行する必要があります。式(1)を用いて、体積流量(Q)は、所与時間(t)内に吐出された量(V)に基づいて算出することができる。推定流速()を計算するには、式(2)で説明した、以前に計算した流量(Q)と容器断面積(A)を使用できます。(1)(2) 3 日ごとに、新鮮な培地で満たされた 1 本のシリンジをポンプに近い培地交換ポートに接続し、空のシリンジをリザーバーに近いポートに接続して、使用済み培地を回収して、培地の 50%(~50 mL)を交換します(図 2)。注:培地交換ポートとして2つの三方弁を使用すると、培地交換中の灌流の連続運転が容易になります。 実験の最後に、滅菌手術用ハサミを使用してバイオリアクターに接続されている端をトリミングすることにより、反応チャンバーから組織を採取します。 さらに使用するために、システムを分解、洗浄、滅菌します。 5. サンプル分析 回収したサンプルを4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で4°Cで一晩固定します。 組織を最適な切断温度(OCT; 材料表を参照)19 に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタンに浸漬して凍結します。 クライオスタットを使用して厚さ3〜5mmのクライオ切片を取得します。 免疫組織化学(ヘマトキシリンおよびエオシン[H&E])および/または免疫蛍光法を実施します。典型的な免疫蛍光プロトコールに従ってください。リン酸緩衝生理食塩水(PBS; 材料表を参照)に浸した20% [v/v]ヤギ血清で、スライスを室温で1時間ブロックします。 スライスをPBSで1:50に希釈したCD31に対する初代ウサギ抗体とともに、4°Cで一晩インキュベートします( 材料表を参照)。 PBSで5分間3回洗浄します。 PBSで1:200希釈した蛍光標識ヤギ抗ウサギ二次抗体およびPBSで1:200希釈したα平滑筋アクチン(SMA)直接標識蛍光抗体と37°Cで1時間インキュベートします( 材料表を参照)。 PBSで5分間3回洗浄します。 PBSで1:1,000に希釈したDAPIで室温で10分間核を染色します。 0.1%(w/v)スーダンブラック( 材料表を参照)を70%(v/v)エタノール中で室温で10分間インキュベートし、組織の自家蛍光を低減します。 豊富な脱イオン水で組織を洗います。スライドを封入剤に取り付けます。 共焦点レーザー走査型顕微鏡でサンプルを画像化します。