Retroorbital Ven Enjeksiyonunun Yenidoğan Kemirgen Modeli
Summary
Bu protokol, yenidoğan dönemi boyunca sıçanlarda ve farelerde kullanılabilecek tekrarlanabilir bir venöz uygulama yolunu göstermeyi amaçlamaktadır. Bu prosedür, öncelikle intravenöz uygulama kullanarak yenidoğan bakım ünitelerinde ilaç uygulamasını yansıtmak isteyen klinik öncesi kemirgen çalışmaları için önemlidir.
Abstract
İntravenöz (iv) enjeksiyon, klinik ortamda yenidoğanlarda en çok kullanılan ilaç uygulama yöntemidir. Bu nedenle, retroorbital ven enjeksiyonu, başarılı kavram kanıtlama çalışmalarının çok ihtiyaç duyulan yenidoğan klinik çalışmalarına ilerleyebileceği araştırmalarda bileşik uygulama için önemli bir yöntemdir. Yenidoğan kemirgenlerinde yapılan intravenöz çalışmaların çoğu yüzeysel temporal / fasiyal veni kullanır. Bununla birlikte, cilt koyulaştıktan ve damar artık görünmedikten sonra 2 günden daha eski yenidoğan kemirgenlerinde retroorbital enjeksiyon güvenilmez hale gelir. Bu protokolde, yüzeyel temporal venin artık görünmediği, ancak gözlerin henüz açılmadığı yaşlarda hem yenidoğan faresinde hem de sıçanlarda venöz sinüsün retroorbital enjeksiyonunu tanımladık. Göz açıklığı, araştırmacının iğneyi yerleştirirken gözü delmediğini net bir şekilde görmesini sağlayarak retro-orbital enjeksiyonu kolaylaştırır. Bu tekniğin yan etkiler olmadan güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde uygulanabileceğini gösteriyoruz. Ek olarak, yenidoğan beyin hasarını incelemek için bileşiklerin uygulanması gibi birçok çalışmada kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Introduction
Hayvan araştırmaları, klinik araştırmalara yol açan önemli bir adımdır ve bu nedenle, hayvan çalışmalarının klinik ortamda gerçekleştirilen prosedürleri ve tedavileri yakından taklit etmesi önemlidir. Bununla birlikte, klinik uygulamaların yenidoğan kemirgen çalışmalarına çevrilmesinde çeşitli zorluklar vardır. Bunlar, yenidoğan kemirgeninin küçük boyutunu ve diğerlerinin yanı sıra yetişkin araştırmalarına kıyasla yenidoğan araştırma ve bilgisindeki boşluğu içerir 1,2.
İlaçlar veya hücreler gibi farklı maddelerin uygulanması, intraperitoneal (ip), subkutan (sc) ve intravenöz (iv) enjeksiyonlar dahil olmak üzere birden fazla yolla gerçekleştirilebilir. İv ile enjeksiyon, insan yenidoğanlarında bileşiklerin uygulanmasının tercihli yoludur. Yenidoğanlarda IV uygulama yolu, ilaçların sistemik dağılımını en üst düzeye çıkarması ve yüksek biyoyararlanıma sahip olması nedeniyle diğer yollara göre avantajlıdır 3,4. Tekrarlanan ilaç uygulaması için bakımlı bir iv hatları kullanılabilir. Kemirgen çalışmalarında, iv enjeksiyonları kuyrukta, yüz/temporal damarlarda veya retroorbital sinüs5’te yapılmalıdır. Kuyruk damarı enjeksiyonu,5 arasından seçim yapabileceğiniz iki lateral kaudal paralel damar sağladığı için yetişkin kemirgenlerde rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu damarlar, yenidoğanlarda kullanımlarını dışlayan küçük bir çapa sahiptir. Yenidoğan iv enjeksiyonlarının çoğu, doğum sonrası 0 (P0)-P2’den görülebildiği ve nispeten büyük hacimli bir uygulamaya izin verdiği için yüzeysel fasiyal / temporal vende gerçekleştirilmiştir5. Bununla birlikte, hayvan cilt rengini kazandığında bu yol P36 civarında güvenilmez hale gelir, böylece yüzeysel yüz/temporal damarın yardımsız gözle görülmesini zorlaştırır. Yenidoğan transvers sinüs yoluyla uygulama iv bir çalışmadatanımlanmıştır 7; ancak bu, transvers sinüsün üzerindeki cildin açılmasını ve bir mikroskop yardımıyla P0-P1’de AAV9’un enjekte edilmesini gerektirir.
Potansiyel bir tedaviyi araştırırken veya ilgili bir yenidoğan yaralanma modeli oluştururken, yenidoğan kemirgenlerinin insanlara kıyasla farklı organ gelişim zamanlamasına sahip olabileceğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Protokolümüz, insanlar ve kemirgenler arasındaki yenidoğan merkezi sinir sistemi gelişimindeki farklılıklara dayanmaktadır. Örnek olarak, yeni doğan insan beyni terimi yaklaşık olarak bir P7 sıçan ve bir P10 fare beyni8’e karşılık gelir. Retroorbital olarak enjekte edilen maddelerin dağılımı diğer iv bölgelerinkine benzer olduğundan, yüksek kan seviyelerine hızla ulaşıldığından, bunu uygun bir yol olarak görüyoruz. Bu teknik, P1-P2 farelerinde oftalmik venöz sinüse bileşikler enjekte edenYardeni ve meslektaşları tarafından iyi tanımlanmıştır 9. Mevcut protokolde, henüz gözlerini açmamış yaşlı yenidoğan kemirgenlerinde retroorbital enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için basit ve uygulanabilir bir yöntem gösterilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, yenidoğan farelerin ve sıçanların retroorbital sinüsüne madde enjeksiyonu için açık ve kesin bir yöntem sağlar. Bu önemlidir, çünkü retroorbital enjeksiyonların, yüzeysel temporal/fasiyal venin artık fark edilemediği P2’den yaşlı kemirgenlerde ve göz kapaklarının henüz açılmadığı ve göz küresinin açığa çıkmadığı P12’den genç hayvanlarda güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde yapılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, yenidoğan retroorbital enjeksiyonu hem yavrular hem de barajlar tarafından iyi tolere edilir ve tekniğe hakim olduktan sonra minimum yan etki riski vardır.
IV yoluyla enjeksiyonlar, damarın yırtılmasını önlemek için enjeksiyon hızının sabit ve düşük tutulmasını şart koşarak, hem düşük hem de yüksek pH’ın yanı sıra yüksek konsantrasyonlu enjeksiyona izin verdikleri için diğer uygulama yollarına göre bir avantaja sahiptir. Ayrıca, iv enjeksiyonları, bileşiklerin doğrudan sistemik dolaşıma girerken daha hızlı dağılmasına izin verir, böylece diğer uygulama yollarında gözlenen zayıf emilimden kaynaklanan potansiyel gecikmeleri atlar. Bu, bileşiklere anında erişim ve yaklaşık% 100 biyoyararlanım sağlar.
Klinik olarak iv, yenidoğanlarda (28 günlük <) tercih edilen uygulama yoludur. Bu, özellikle yenidoğan yoğun bakım ortamlarında geçerlidir, çünkü iv kanülasyon, ilaçlar / sıvılar sağlamak için kolay erişim sağlar. SC yolu ile enjeksiyonlar, yenidoğanlarda, özellikle eritropoietin15’in uygulanması için bir şekilde kullanılmıştır. Bununla birlikte, iv infüzyonunu üstün bir alternatif olarak öneren bir çalışma ile endişeler dile getirilmiştir16. Oral uygulama, yenidoğanlar hastane yoğun ünite ortamında olduğunda genellikle pratik bir seçenek değildir. Ek olarak, yetişkinlerle karşılaştırıldığında, yenidoğanların gastrointestinal sistemlerinde, gecikmiş mide boşalması ve ilaç emilimini etkileyebilecek azalmış bağırsak hareketliliği dahil olmak üzere farklılıklar vardır. Yenidoğanların küçük kas kütlesinin bir sonucu olarak kas içi enjeksiyonların uygulanması zordur 3,4.
Kemirgen araştırmalarında en yaygın kullanılan iv enjeksiyon yöntemlerinden biri kuyruk damarı enjeksiyonudur. Bununla birlikte, yenidoğanlarla çalışırken bu yöntem uygun değildir. Yüzeyel temporal/fasiyal ven6 gibi diğer iv bölgeleri P3’te görünmez hale gelir. Neonatal transvers sinüs bir çalışmada tanımlanmıştır ve P0-P1’de gerçekleştirilmiştir ve mikroskop yardımıyla cildi açarak ve kafatasından transvers sinüse bir kılcal iğne ilerleterek 2-4 μl hacimli enjeksiyonlara izin vermiştir7. Sıçanlarda P7’de dış juguler venin kullanımını belgeleyen az sayıda çalışmavardır 17. Ancak bu, cildin cerrahi olarak açılmasını ve dış juguler venin18 açığa çıkarılmasını gerektiren invaziv bir tekniktir. Yetişkin kemirgenlerde yapılan çalışmalarda, retroorbital uygulamanın kuyruk ven enjeksiyonu5 kadar etkili olduğu ve böylece retroorbital yolun canlılığını ve alaka düzeyini güçlendirdiği gösterilmiştir. Retroorbital enjeksiyon minimum sıkıntıya neden olur ve bir kez ustalaştıktan sonra minimum ekipmanla tek bir kişi tarafından gerçekleştirilebilir ve birden fazla enjeksiyona izin verir (gözlerin değiştirilmesini sağlar). Önceki çalışmalar, retroorbital enjeksiyonun, P0-P1 veya P14-P2111’de veya P1719’da FITC-dekstran’da farelerde adeno-ilişkili virüs 9’u uygulamak için kullanıldığını göstermiştir, bu da bu yöntemin artan bir şekilde kabul edildiğini göstermektedir.
Yenidoğanlarda retroorbital enjeksiyonla ilişkili bazı sınırlamalar vardır. Tüm iv enjeksiyonlarında olduğu gibi, enjekte edilen hacim sınırlıdır ve bu prosedür için 5 μL / g öneriyoruz. Ek olarak, retroorbital enjeksiyon tüm vücut anestezisi gerektirir. Komplikasyonları en aza indirmek için, anestezi indüksiyonunda daha hızlı oldukları, hızlı metabolizmaya sahip oldukları ve hızlı iyileşme oranına sahip oldukları için izofluran gibi inhale anestezi ajanlarının kullanılması önerilmektedir. İğne eğiminin yanlış yerleştirilmesi nedeniyle enjeksiyon bölgesi çevresinde potansiyel şişmeyi veya göz travmasını önlemek için, tercihen terminal anestezi uygulanmış hayvanlarda renkli boya kullanılarak eğitim gereklidir. Bu hayvanların küçük boyutları nedeniyle, küçük iğne ölçülü daha ince iğneler gereklidir. Damarların tıkanmasını önlemek ve hücre canlılığını sağlamak için hücre enjeksiyonu tek hücreli süspansiyonda yapılmalıdır. Cesaret verici bir şekilde, Amer ve meslektaşları tarafından yapılan bir çalışma, 30 G şırınga kullanılarak memeli hücrelerinin enjeksiyonunun, yüksek hücre yoğunluğu ejeksiyonunda bile güvenilir hücre canlılığı sağladığını göstermiştir20.
Özetle, yenidoğanlarda güvenilir bir iv yolunun oluşturulması, insanlarda tercih edilen uygulama yolu olduğu için klinik öneme sahiptir. Retroorbital enjeksiyon kolayca yönetilebilir, tekrarlanabilir ve kemirgen yenidoğan dönemi boyunca güvenilir bir şekilde kullanılamayan kuyruk ve temporal/fasiyal ven gibi diğer iv enjeksiyon bölgelerine uygun bir alternatif sağlar. Böylece, yenidoğan retroorbital enjeksiyonu, ilaçların, hücrelerin ve diğer bileşiklerin uygun yenidoğan yaşlarında verilmesine izin verir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokolde gerçekleştirilen çalışmalar Hasselblad Vakfı (2020-2021, ERF), Åke Wibergs Vakfı (M19-0660, ERF), İsveç Araştırma Konseyi (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Sahlgrenska Üniversite Hastanesi Halk Sağlığı Servisi (ALFGBG-965174, HH; ALFGBG-966107, CM), İsveç Beyin Vakfı (FO2022-0110, CM), Åhlen Vakfı (223005, CM) ve Avrupa Birliği Horizon 2020 Çerçeve Programı (hibe sözleşmesi no. 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice). J Vis Exp. , e52037 (2014).
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
