Analisi dell'ereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter fluorescente e l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

NOTA: Nella Figura 1 è fornita una sequenza temporale del saggio. 1. Preparazione di piastre per la crescita di nematodi RNAi (RNAi-NGM) Eliminare E. coli HT115(DE3) contenente GFP o vettori RNAi di controllo da stock di glicerolo su piastre di agar Luria-Bertani (LB) integrate con 100 μg/mL di ampicillina. Incubare i batteri per una notte a 37 °C. Il giorno seguente, preparare le piastre RNAi-NGM (1,7% [p/v] agar, 0,3% [p/v] NaCl, 0,25% [p/v] peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL di colesterolo, 25 mM tampone fosfato di potassio [pH 6,0], 1 mM MgSO4, 25 μg/mL di carbenicillina e 5 mM isopropilico β-d-1-tiogalattopiranoside [IPTG]) secondo il protocollo standard18.Per ciascun ceppo del saggio, preparare un minimo di sei piastre RNAi-NGM seminate con GFP RNAi (due piastre per ciascuna delle tre repliche biologiche) e due piastre RNAi-NGM seminate con RNAi di controllo (una replica biologica). Copri le piastre con un foglio di alluminio per proteggerle dalla luce e lasciale asciugare per una notte a temperatura ambiente. Lo stesso giorno del versamento della piastra RNAi-NGM, preparare 4 mL di colture liquide di batteri RNAi.In condizioni sterili, aliquota di 4 mL di brodo LB integrato con 10 μg/mL di tetraciclina e 100 μg/mL di ampicillina in provette di coltura. Prelevare singole colonie dalle piastre di agar LB in ciascuna provetta e incubare per una notte agitando per circa 16 ore a 37 °C. Seminare i batteri RNAi sulle piastre RNAi-NGM.Dopo la crescita notturna, misurare la densità ottica (OD600) delle colture utilizzando una diluizione 1:5 dei batteri con brodo LB. Diluire i batteri RNAi a un OD relativo di 600 di 2 utilizzando brodo LB integrato con 10 μg/mL di tetraciclina e100 μg/mL di ampicillina. In condizioni sterili, aggiungere 150 μL di batteri RNAi di controllo o GFP su ciascuna piastra RNAi-NGM. Coprire le piastre con un foglio di alluminio e lasciare crescere i batteri per almeno 24 ore a temperatura ambiente prima dell’uso.NOTA: Le piastre RNAi-NGM non utilizzate possono essere conservate capovolte per un massimo di 1 settimana a 4 °C in un contenitore sigillato al buio. 2. Avvio del saggio di ereditarietà dell’RNAi: sbiancamento e placcatura di embrioni per la generazione di P0 NOTA: Prima di iniziare il saggio di ereditarietà dell’RNAi, i vermi contenenti il reporter GFP mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3’UTR]7 devono essere mantenuti senza fame a 21 °C per almeno due generazioni. A 4 giorni (96 ore) prima dell’inizio del test di ereditarietà dell’RNAi (Figura 1), prelevare tre o quattro adulti gravidi su ciascuna piastra NGM standard da 35 mm seminata con batteri OP50-1.NOTA: Sono sufficienti tre piastre NGM per ceppo. Per i ceppi con fertilità compromessa, possono essere necessari più di quattro animali per piastra. Dopo 4 giorni, assicurarsi che la popolazione adulta abbia iniziato a deporre gli embrioni sulla piastra. Lavare i vermi dalle piastre in provette da 1,5 mL utilizzando 800 μL di tampone M9 integrato con Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4, 0,01% (v/v) TX-100). Ripetere il lavaggio e il pooling nello stesso tubo. Isolare gli embrioni dalla popolazione mediante sbiancamento come segue.Preparare una soluzione sbiancante con candeggina (ipoclorito di sodio al 6%) e 10 N NaOH in un rapporto di volume di 1,5:1. Preparare una quantità sufficiente in modo tale da poter utilizzare 250 μL per ciascun campione. Centrifugare le provette da 1,5 mL con i vermi a 1.000 x g per 1,5-2 min. Aspirare il surnatante, lasciando 100 μL senza disturbare il “pellet” del verme. In alternativa, i tubi possono essere lasciati per circa 2 minuti per consentire ai vermi di depositarsi prima di aspirare. Aggiungere 650 μL di ddH2O a ciascuna provetta per ottenere un volume finale di 750 μL.NOTA: I seguenti passaggi sono sensibili al fattore tempo. Aggiungere 250 μL di soluzione sbiancante in ciascuna provetta e avviare un timer. Ogni 1-2 minuti, agitare accuratamente i tubi. Dopo 5 minuti, controllare i vermi sotto lo stereoscopio per monitorare la degradazione degli adulti. Continuare a vorticare fino a quando i vermi non si sono completamente sciolti e rimangono solo embrioni. Centrifugare immediatamente le provette a 1.000 x g per 1,5 min.NOTA: Lo sbiancamento è generalmente completo entro 6-7 minuti, ma deve essere monitorato con uno stereoscopio con un ingrandimento sufficiente per osservare gli embrioni rilasciati (40x). Non lasciare i vermi nella candeggina per un periodo prolungato, poiché ciò comprometterebbe gli embrioni. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e lasciare circa 50-100 μL. Aggiungere 1 mL di tampone M9 con TX-100 per lavare e miscelare mediante vortex. Centrifugare di nuovo a 1.000 x g per 1,5-2 minuti e lavare almeno altre due volte. Aspirare il surnatante dal lavaggio finale e lasciare circa 100 μL nella provetta. Miscelare mediante vortex. Pipettare due volte 2 μL da ciascuna provetta su un vetrino etichettato. Contare gli embrioni utilizzando un contatore per stimare la concentrazione di embrioni per microlitro.NOTA: I vetrini con più pozzetti smerigliati possono essere utilizzati qui per contare le repliche di più ceppi. I vetrini di conteggio possono essere lavati e riutilizzati. Per avviare una crescita semi-sincronizzata della popolazione, miscelare e pipettare un volume contenente 250 embrioni su ciascuna piastra RNAi-NGM. Utilizzare due piastre per ogni replica. Lasciare assorbire il liquido. Per la generazione P0 trattata con RNAi, incubare a 21 °C per 4 giorni (96 h) (dagli embrioni all’età adulta). I tempi possono variare a seconda del genotipo. Figura 1: Schema del saggio di ereditarietà dell’RNAi. Tempistica proposta per la preparazione della piastra RNAi-NGM e l’impostazione del saggio di ereditarietà RNAi. Gli adulti gravidi vengono raccolti il giorno -4 su piastre NGM seminate con OP50-1. Dopo 4 giorni, la progenie adulta viene sbiancata e gli embrioni vengono placcati su piastre RNAi-NGM. La generazione di P0 è esposta all’RNAi per 4 giorni a 21 °C. Una volta che i vermi raggiungono l’età adulta, le repliche vengono passate per sbiancamento e valutate per l’espressione germinale della GFP ad ogni generazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 3. Passare e assegnare un punteggio a ciascuna generazione per l’espressione germinale della GFP NOTA: Per facilitare l’incisione, utilizzare un disco in vinile per creare cuscinetti di agarosio con creste lineari per allineare i vermi. Questo metodo è stato adattato da Rivera Gomez e Schvarzstein19. Preparare l’agarosio all’1% (p/v) sciogliendo l’agarosio in ddH2O in un matraccio riscaldandolo in microonde. Aggiungere una barra per mescolare e coprire con un foglio. In caso di rifusione, scaldare l’agarosio su una piastra a 200 °C mescolando. Una volta sciolto, abbassate la fiamma a 80 °C. Lavare via i vermi dalle piastre NGM utilizzando 800 μL di tampone M9 con TX-100 in una provetta da 1,5 mL. Lavare le piastre due volte per rimuovere tutti gli adulti gravidi. Controllare le piastre sotto lo stereoscopio per confermare che gli animali sono stati raccolti in modo efficiente. Centrifugare le provette a 1.000 x g per 1,5-2 minuti o lasciare che i vermi si depositino per 2 minuti. Aspirare il surnatante e lasciare 100 μL senza disturbare il “pellet” del verme. Preparare i cuscinetti di agarosio per il montaggio dei vermi come segue.Mettere una goccia di agarosio fuso all’1% (p/v) sul disco in vinile (descritto in precedenza19) usando una pipetta Pasteur di vetro (con l’estremità stretta rotta). Orientare un vetrino in modo che le linee sul disco siano orizzontali o verticali e posizionare rapidamente il vetrino sulla goccia di agarosio. Attendere circa 30 secondi prima di rimuovere il vetrino dal disco.NOTA: Se si segnano più genotipi, può essere utile fare un tampone di agarosio più grande su un vetrino e tagliarlo a metà usando una lama. Montare i vermi sui cuscinetti di agarosio.Sotto lo stereoscopio, aggiungere circa 5 μL di levamisolo 5 mM al cuscinetto di agarosio. La diluizione con levamisolo deve essere preparata fresca ogni settimana. Muovere delicatamente i tubi di vermi per mescolare e trasferire 5-10 μL di vermi sul tampone di agarosio. Stimare il numero di vermi a occhio mentre vengono aggiunti, in modo che ci siano circa 40 vermi per replica. Allinea i vermi in file usando un plettro per ciglia per facilitare l’incisione. Aggiungi un vetrino coprioggetti.NOTA: I vetrini con animali montati in questo modo possono durare diverse ore prima di asciugarsi. Isolare gli embrioni dagli animali rimanenti utilizzando il protocollo di sbiancamento (fare riferimento al punto 2.3) prima di assegnare un punteggio ai vetrini. Placcare 250 embrioni su piastre NGM da 35 mm seminate con OP50-120. Una volta assorbito il liquido, capovolgere le piastre e rimetterle nell’incubatore a 21 °C. Utilizzare uno stereoscopio a fluorescenza con un set di filtri GFP. Contare e registrare il numero di vermi GFP positivi e GFP negativi sui vetrini per ogni replica utilizzando un contatore di conteggio.NOTA: I vermi GFP positivi avranno un’espressione nucleare di GFP nella loro linea germinale e negli embrioni in utero. Le linee germinali dei vermi GFP negativi non saranno fluorescenti, tuttavia, quando la GFP inizia a riaccendersi nelle generazioni successive, la fluorescenza potrebbe essere fioca. Può essere utile montare ulteriori ceppi di vermi non transgenici per tenere conto dell’eventuale autofluorescenza osservata. Passaggio della popolazione per sbiancamento, come sopra descritto, ogni 4 giorni circa (96 h) a 21 °C. In alternativa, il passaggio può essere effettuato con un programma alternato di 3 giorni/4 giorni per comodità. Impiattare ~50 embrioni in più per le generazioni di passaggio più brevi se alternati, poiché potrebbe esserci una resa inferiore di embrioni dopo 72 ore.NOTA: Mantenere costante il tempo di passaggio della generazione P0 a 4 giorni dopo la placcatura degli embrioni. 4. Raccolta di animali per ChIP NOTA: Il numero di animali e la tempistica dipendono dal ceppo, dallo stadio di sviluppo, dall’epitopo e dal numero di bersagli di immunoprecipitazione (IP). Nell’esempio seguente, raccogliere gli animali per tre IP: H3K9me3, istone H3 e controllo IgG. Il protocollo ChIP è stato adattato da Askjaer et al.21. Prima della raccolta del campione ChIP, espandere la generazione precedente del saggio di ereditarietà dell’RNAi di altre tre piastre NGM (ad almeno quattro piastre per replica). Coltivare per 4 giorni a 21 °C. Sbiancare gli adulti gravidi per isolare gli embrioni (fare riferimento al punto 2.3). Per ogni ceppo, impiattare circa 3.500 embrioni su 14 piastre (250 per piastra) e far crescere per 3 giorni a 21 °C fino allo stadio di giovane adulto. Lavare gli animali in provette da 1,5 mL con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente lo 0,01% (v/v) di TX-100 (PBS/TX). Centrifugare a 1.000 x g per 2 min. Aspirare e raggruppare gli animali di un ceppo in una provetta e lavare altre tre volte con almeno 1 mL di PBS/TX. Aspirare a 1.000 μL, capovolgere per miscelare e contare il numero di animali in 3 μL per tre volte (fare riferimento al punto 2.3.9). Calcolare la concentrazione di animali e trasferire un volume corrispondente a 3.000 animali in una nuova provetta per la reticolazione della formaldeide. Assicurarsi che il volume totale sia almeno 10 volte il volume del pellet di vite senza fine. 5. Reticolazione della formaldeide ATTENZIONE: Lavorare con la formaldeide in una cappa aspirante per prevenire l’esposizione al vapore. Aggiungere formaldeide (concentrazione finale dell’1,8%) nella provetta contenente i vermi. Ruotare a temperatura ambiente per 6 min. Congelare immediatamente in azoto liquido. In questa fase l’esperimento può essere messo in pausa e i campioni possono essere conservati a -80 °C. Scongelare il campione reticolato a bagnomaria a temperatura ambiente per 3 minuti e ruotare per 16 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 1,25 M di glicina a una concentrazione finale di 125 mM e ruotare per 5 minuti.NOTA: Fino all’eluizione delle microsfere magnetiche, conservare i campioni su ghiaccio o a 4 °C e utilizzare tamponi ghiacciati. Centrifugare il campione a 1.000 x g per 3 minuti. Lavare tre volte con 1 mL di PBS/TX ogni volta. Lavare due volte con 1 mL di tampone di risospensione (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA], 0,01% TX-100, inibitore della proteasi [una compressa per 5 mL]). Dopo l’ultimo lavaggio, lasciare una quantità sufficiente di tampone per garantire che il volume totale sia almeno tre volte il volume del pellet e un minimo di ~100 μL. 6. Sonicazione NOTA: I parametri di sonicazione dipendono dal tipo e dal modello del sonicatore e dello stadio animale. Parametri come il volume e la concentrazione del campione, gli intervalli di accensione/spegnimento, il numero di cicli e l’impostazione della potenza devono essere ottimizzati empiricamente. Ad esempio, nel corso di un periodo di sonicazione, monitorare la lisi dei vermi utilizzando un saggio proteico e determinare quando la concentrazione raggiunge un plateau. Inoltre, monitorare quando la dimensione media di taglio del DNA genomico è di circa 200-1.000 bp mediante elettroforesi del DNA, purificato dopo l’inversione della reticolazione, su un gel di agarosio/tris-acetato-EDTA (TAE) all’1,5%. Misurare il volume dei campioni del passaggio precedente. Miscelare e aliquotare 90-120 μL in un tubo di sonicazione in polistirolo. Aggiungere un volume uguale di tampone di risospensione contenente 2 detergenti (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,2% desossicolato di sodio, 0,7% sarkosyl). Sonicare in un sonicatore a bagnomaria al 50% della potenza per 7 min (20 s acceso/40 s spento) a 4 °C. Miscelare delicatamente mediante pipettaggio. Ripetere la sonicazione per altri 7 minuti. Trasferire il lisato sonicato in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 0,5 volumi di tampone di risospensione senza detergenti (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA) (ad esempio, aggiungere 100 μL di tampone a 200 μL di campione). Centrifugare a 13.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Conservare il surnatante del lisato e trasferirlo in una nuova provetta. Facoltativamente, eseguire un test proteico per determinare le concentrazioni di ciascun lisato. Questo passaggio può essere utile per grandi quantità di campione o confronti tra saggi. Tuttavia, la standardizzazione del numero di animali come descritto sopra funziona bene per le quantità di campione qui descritte, poiché esiste una migliore correlazione con la resa di cromatina/DNA determinata dalla qPCR. 7. Immunoprecipitazione NOTA: Adattare la quantità di anticorpi e microsfere magnetiche al volume e alla concentrazione del lisato Dividere il surnatante del lisato in quattro porzioni: tre volumi uguali per ogni IP e il 10% del volume di un IP come ingresso (ad esempio, 100 μL di IP #1, 100 μL di IP #2, 100 μL di IP #3, 10 μL di ingresso). Trasferire il lisato IP in una provetta PCR da 200 μL e conservare il lisato di ingresso a -20 °C in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 0,5 μg di anticorpo anti-H3K9me3, anticorpo anti-istone H3 o IgG al campione IP appropriato. Incubare a 4 °C per una notte con rotazione. Il giorno seguente, aliquotare 9 μL di microsfere magnetiche rivestite di proteina G per IP in una singola provetta da 1,5 mL. Lavare le perle due volte con 1 mL di FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 1% TX-100, 0,1% desossicolato di sodio). Risospendere le perle magnetiche nel tampone FA-150 al volume originale prelevato dal magazzino nel passaggio 7.3 di cui sopra. Aggiungere 7,5 μL a ciascun IP. Incubare a 4 °C per 2 h con rotazione. 8. Lavaggi ed eluizione NOTA: Per garantire che le microsfere magnetiche non si asciughino, aggiungere rapidamente ogni lavaggio o tampone di eluizione dopo aver aspirato il lavaggio precedente. Utilizzare ogni volta 0,2-1 mL delle seguenti soluzioni tampone per lavare le perle. Raccogli le perline su un supporto magnetico per aspirare i lavaggi. Incubare ogni lavaggio a 4 °C per 5 minuti con rotazione. Segui l’ordine come di seguito.Lavare due volte con FA-150. Lavare una volta con FA-1M (FA-150 con 1 M NaCl). Lavare una volta con FA-0.5M (FA-150 con 0.5 M NaCl). Trasferire in una nuova provetta PCR. Lavare una volta con TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% desossicolato di sodio). Lavare due volte con TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 0,005% IGEPAL CA-630).NOTA: Continuare l’elaborazione del campione a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. Aspirare l’ultimo tampone di lavaggio. Risospendere le biglie magnetiche con 50 μL di tampone di eluizione ChIP (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% sodio dodecil solfato [SDS]) e trasferire in una provetta da 1,5 mL. Eluire a 65 °C per 15 minuti in termomiscelatore con miscelazione a 1.000 giri/min per 5 secondi al minuto. Raccogli le perline su un supporto magnetico e trasferisci il surnatante in una nuova provetta. Ripetere l’eluizione con altri 50 μL di tampone di eluizione ChIP. Raggruppare i surnatanti per un totale di 100 μL. Procedere alla reticolazione inversa e all’eluizione del DNA, come descritto di seguito. 9. Reticolazione inversa ed eluizione del DNA Scongelare il campione di lisato in ingresso. Rabboccare fino a 100 μL con tampone di eluizione ChIP. Aggiungere 16,5 μg di RNasi A a ciascun campione IP e di ingresso. Incubare a 37 °C per 1 h. Aggiungere 40 μg di proteinasi K e incubare a 55 °C per 2 ore. Quindi, incubare a 65 °C per una notte. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente e purificare il DNA con un kit di colonna rotante. 10. Impostazione ed esecuzione della reazione qPCR NOTA: Il primer, la configurazione della reazione e i parametri del termociclatore devono essere modificati in modo che corrispondano alle raccomandazioni del produttore per la miscela di reazione qPCR in uso. Preparare set di primer mirati al reporter GFP RNAi e alle regioni di controllo dell’arricchimento positivo e negativo H3K9me3. La temperatura di fusione del primer è di 60 °C. Vedere la tabella dei materiali per le sequenze di primer. Per il DNA in ingresso, effettuare quattro diluizioni seriali quadruple (ad esempio, 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).NOTA: L’IP DNA può essere utilizzato direttamente o diluito (ad esempio, 1:2 o 1:3) per consentire più reazioni. L’idoneità della diluizione deve essere determinata empiricamente, poiché le prestazioni della qPCR possono essere influenzate. Organizzare tutte le reazioni corrispondenti a un set di primer su una piastra PCR. Impostare le reazioni tecniche duplicate per ogni diluizione del DNA in ingresso e per ogni campione di DNA IP. Ogni reazione da 10 μL contiene 1,5 μL di DNA in ingresso o IP (o tampone di eluizione come controllo), miscela master qPCR (1x concentrazione finale), primer diretto e primer inverso (concentrazione finale di 400 nM per ciascun primer). Su un termociclatore in tempo reale, eseguire il seguente programma: denaturazione iniziale: 95 °C per 4 min; amplificazione e rivelazione di fluorescenza: 40 cicli di 95 °C per 10 s e 60 °C per 30 s con lettura su piastra; prolungamento finale: 60 °C per 5 min; curva di fusione: da 60 °C a 90 °C con incrementi di 0,5 °C, 5 s per passo. 11. Determinazione dell’efficienza di amplificazione e verifica della specificità del prodotto Per ogni serie di diluizioni del DNA in ingresso, tracciare i quattro punti dati con [log10(1/diluizione)] sull’asse x e [Input Cq] sull’asse y. Determinare la pendenza della linea di adattamento. Calcola l’efficienza di amplificazione. I set di primer ideali dovrebbero mostrare costantemente un’efficienza del 95%-100%. Verificare che tutte le reazioni abbiano un picco acuto della curva di fusione e che le reazioni con lo stesso primer impostato abbiano la stessa temperatura di fusione. Picchi multipli o diverse temperature di fusione possono indicare un’amplificazione non specifica. Facoltativamente, eseguire le reazioni su un gel standard di agarosio/TAE al 2% a temperatura ambiente per verificare le dimensioni della banda del prodotto. 12. Calcolo della percentuale di input Calcolare il fattore di diluizione in ingresso. Poiché il 10% del volume di lisato IP è stato salvato come input, il fattore di diluizione per la diluizione 1:5 del DNA in ingresso è 50. Determinare il fattore di diluizione IP. Se il DNA IP non viene diluito prima della qPCR, il fattore di diluizione è 1. Calcolare la differenza Cq tra l’IP e l’ingresso regolato per i fattori di diluizione. Calcola la percentuale di input.