Analyse der transgenerationalen epigenetischen Vererbung in C. elegans mittels Fluoreszenzreporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt einen Zeitplan für den Assay. 1. Herstellung von RNAi-Nematoden-Wachstumsmedium-Platten (RNAi-NGM) E. coli HT115(DE3), das entweder GFP- oder Kontroll-RNAi-Vektoren aus Glycerinstämmen enthält, auf Luria-Bertani (LB)-Agarplatten auftragen, die mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt werden. Inkubieren Sie die Bakterien über Nacht bei 37 °C. Am nächsten Tag werden RNAi-NGM-Platten (1,7 % [w/v] Agar, 0,3 % [w/v] NaCl, 0,25 % [w/v] Pepton, 1 mM CaCl2, 5 μg/ml Cholesterin, 25 mM Kaliumphosphatpuffer [pH 6,0], 1 mM MgSO4, 25 μg/ml Carbenicillin und 5 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid [IPTG]) gemäß dem Standardprotokoll18 hergestellt.Bereiten Sie für jeden Stamm im Assay mindestens sechs RNAi-NGM-Platten mit GFP-RNAi (zwei Platten für jedes der drei biologischen Replikate) und zwei RNAi-NGM-Platten mit Kontroll-RNAi (ein biologisches Replikat) vor. Die Platten zum Schutz vor Licht locker mit Folie abbinden und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen. Am selben Tag wie das Ausgießen der RNAi-NGM-Platte 4 ml Flüssigkulturen von RNAi-Bakterien vorbereiten.Unter sterilen Bedingungen werden 4 ml LB-Bouillon aliquot mit 10 μg/ml Tetracyclin und 100 μg/ml Ampicillin in Kulturröhrchen gegeben. Entnehmen Sie einzelne Kolonien aus den LB-Agarplatten in jedes Röhrchen und inkubieren Sie sie über Nacht unter ca. 16 h Schütteln bei 37 °C. Säen Sie RNAi-Bakterien auf die RNAi-NGM-Platten.Messen Sie nach dem Wachstum über Nacht die optische Dichte (OD600) der Kulturen mit einer 1:5-Verdünnung der Bakterien mit LB-Brühe. Verdünnen Sie RNAi-Bakterien auf einen relativen OD von 600 von 2 mit LB-Bouillon, ergänzt mit 10 μg/ml Tetracyclin und100 μg/ml Ampicillin. Geben Sie unter sterilen Bedingungen 150 μl der Kontroll- oder GFP-RNAi-Bakterien auf jede RNAi-NGM-Platte. Planen Sie die Platten mit Folie und lassen Sie die Bakterien vor der Verwendung mindestens 24 h bei Raumtemperatur wachsen.HINWEIS: Unbenutzte RNAi-NGM-Platten können invertiert bis zu 1 Woche bei 4 °C in einem verschlossenen Behälter im Dunkeln gelagert werden. 2. Start des RNAi-Vererbungsassays: Bleichen und Plattieren von Embryonen für die P0-Generation HINWEIS: Vor Beginn des RNAi-Vererbungstests sollten Würmer, die den GFP-Reporter mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3’UTR]7 enthalten, mindestens zwei Generationen lang bei 21 °C unverhungert bleiben. 4 Tage (96 Stunden) vor Beginn des RNAi-Vererbungstests (Abbildung 1) werden drei oder vier schwangere Erwachsene auf jede 35-mm-Standard-NGM-Platte mit OP50-1-Bakterien gepickt.HINWEIS: Drei NGM-Platten pro Stamm sind ausreichend. Für Stämme mit beeinträchtigter Fruchtbarkeit können mehr als vier Tiere pro Platte erforderlich sein. Stellen Sie nach 4 Tagen sicher, dass die erwachsene Bevölkerung begonnen hat, Embryonen auf die Platte zu legen. Waschen Sie die Würmer von den Platten in 1,5-ml-Röhrchen mit 800 μl M9-Puffer, ergänzt mit Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4, 0,01 % (v/v) TX-100). Wiederholen Sie den Waschvorgang und geben Sie ihn in dieselbe Röhre. Isolieren Sie die Embryonen aus der Population durch Bleichen wie folgt.Bereiten Sie eine Bleichlösung mit Bleichmittel (6% Natriumhypochlorit) und 10 N NaOH in einem Volumenverhältnis von 1,5:1 vor. Bereiten Sie eine ausreichende Menge vor, so dass für jede Probe 250 μl verwendet werden können. Zentrifugieren Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Würmern bei 1.000 x g für 1,5-2 Minuten. Saugen Sie den Überstand an und lassen Sie 100 μl übrig, ohne das “Pellet” des Wurms zu stören. Alternativ können die Röhrchen auch ca. 2 Minuten einwirken lassen, damit sich die Würmer vor dem Absaugen absetzen können. Geben Sie 650 μl ddH2O in jedes Röhrchen, um ein Endvolumen von 750 μl zu erreichen.HINWEIS: Die folgenden Schritte sind zeitkritisch. Geben Sie 250 μl der Bleichlösung in jedes Röhrchen und starten Sie einen Timer. Alle 1-2 Minuten die Röhrchen gründlich vortexen. Untersuchen Sie nach 5 Minuten die Würmer unter dem Stereoskop, um den Abbau der erwachsenen Tiere zu überwachen. Fahren Sie mit dem Wirbel fort, bis sich die Würmer vollständig aufgelöst haben und nur noch Embryonen übrig bleiben. Die Röhrchen werden sofort bei 1.000 x g für 1,5 min zentrifugiert.HINWEIS: Das Bleaching ist in der Regel innerhalb von 6-7 Minuten abgeschlossen, sollte aber unter einem Stereoskop mit einer Vergrößerung überwacht werden, die ausreicht, um die freigesetzten Embryonen (40x) zu beobachten. Lassen Sie die Würmer nicht über einen längeren Zeitraum in Bleichmittel, da dies die Embryonen beeinträchtigt. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und ca. 50-100 μl übrig gelassen. 1 ml M9-Puffer mit TX-100 zum Waschen und Mischen durch Wirbel hinzufügen. Erneut bei 1.000 x g für 1,5-2 min zentrifugieren und mindestens zwei weitere Male waschen. Saugen Sie den Überstand aus der letzten Wäsche an und lassen Sie ca. 100 μl im Röhrchen. Mischen Sie durch Vortexing. Pipettieren Sie 2 μl aus jedem Röhrchen zweimal auf einen beschrifteten Objektträger. Zählen Sie die Embryonen mit einem Zählzähler, um die Konzentration der Embryonen pro Mikroliter zu schätzen.HINWEIS: Objektträger mit mehreren mattierten Vertiefungen können hier verwendet werden, um Replikate mehrerer Stämme zu zählen. Zählobjektträger können gewaschen und wiederverwendet werden. Um ein halbsynchronisiertes Populationswachstum zu starten, mischen und pipettieren Sie ein Volumen mit 250 Embryonen auf jede RNAi-NGM-Platte. Verwenden Sie für jede Replikation zwei Platten. Lassen Sie die Flüssigkeit einziehen. Für die mit RNAi behandelte P0-Generation wird bei 21 °C für 4 Tage (96 h) inkubiert (vom Embryo bis ins Erwachsenenalter). Der Zeitpunkt kann je nach Genotyp variieren. Abbildung 1: Schematische Darstellung des RNAi-Vererbungsassays. Vorgeschlagener Zeitplan für die RNAi-NGM-Plattenvorbereitung und den Aufbau des RNAi-Vererbungsassays. Trächtige adulte Tiere werden am Tag -4 auf NGM-Platten gepflückt, die mit OP50-1 besät sind. Nach 4 Tagen werden die erwachsenen Nachkommen gebleicht und die Embryonen auf RNAi-NGM-Platten plattiert. Die P0-Generation wird 4 Tage lang bei 21 °C RNAi ausgesetzt. Sobald die Würmer das Erwachsenenalter erreicht haben, werden die Replikate durch Bleiche durchlaufen und in jeder Generation für die GFP-Expression der Keimbahn bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 3. Passage und Bewertung jeder Generation auf GFP-Expression in der Keimbahn HINWEIS: Um das Scoring zu erleichtern, verwenden Sie eine Vinyl-Schallplatte, um Agarose-Pads mit linearen Rillen zu erstellen, um die Würmer auszurichten. Diese Methode wurde von Rivera Gomez und Schvarzstein19 übernommen. Man bereitet 1 % (w/v) Agarose vor, indem man Agarose inddH2Oin einem kleinen Kolben durch Erhitzen in der Mikrowelle auflöst. Einen Rührstab hinzufügen und mit Folie abdecken. Beim Umschmelzen die Agarose auf einer Heizplatte bei 200 °C unter Rühren erhitzen. Nach dem Schmelzen die Hitze auf 80 °C reduzieren. Waschen Sie die Schnecken von den NGM-Platten mit 800 μl M9-Puffer mit TX-100 in ein 1,5-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Teller zweimal, um alle trächtigen Erwachsenen zu entfernen. Überprüfen Sie die Platten unter dem Stereoskop, um sicherzustellen, dass die Tiere effizient gesammelt wurden. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.000 x g für 1,5-2 Minuten oder lassen Sie die Würmer 2 Minuten lang ruhen. Saugen Sie den Überstand an und lassen Sie 100 μl stehen, ohne das Wurm-“Pellet” zu stören. Agarose-Pads für die Montage der Würmer wie folgt vorbereiten.Geben Sie einen Tropfen geschmolzener 1%iger Agarose (w/v) mit einer Pasteurpipette aus Glas (wobei das schmale Ende abgebrochen ist) auf die Schallplatte (siehe19). Richten Sie einen Objektträger so aus, dass die Linien auf der Platte entweder horizontal oder vertikal verlaufen, und legen Sie den Objektträger schnell auf den Agarosetropfen. Warten Sie ca. 30 Sekunden, bevor Sie den Objektträger aus der Schallplatte entfernen.HINWEIS: Wenn Sie mehrere Genotypen bewerten, kann es nützlich sein, ein größeres Agarose-Pad auf einem Objektträger herzustellen und es mit einer Klinge in zwei Hälften zu schneiden. Montieren Sie die Würmer auf den Agarose-Pads.Geben Sie unter dem Stereoskop etwa 5 μl 5 mM Levamisol in das Agarose-Pad. Die Levamisol-Verdünnung sollte jede Woche frisch gemacht werden. Schnippen Sie vorsichtig die Röhrchen mit den Würmern, um sie zu mischen, und übertragen Sie 5-10 μl Würmer auf das Agarose-Pad. Schätzen Sie die Anzahl der Würmer mit Augenmaß, wenn sie hinzugefügt werden, so dass es ungefähr 40 Würmer pro Replikat gibt. Richte die Würmer mit einem Wimpernpickel in Reihen aus, um das Scoring zu erleichtern. Fügen Sie ein Deckglas hinzu.HINWEIS: Dias mit Tieren, die auf diese Weise montiert sind, können mehrere Stunden halten, bevor sie trocknen. Isolieren Sie die Embryonen von den übrigen Tieren anhand des Bleichprotokolls (siehe Schritt 2.3), bevor Sie die Objektträger ritzen. Platte 250 Embryonen auf 35 mm NGM-Platten, die mit OP50-120 ausgesät sind. Sobald die Flüssigkeit aufgesogen ist, drehen Sie die Platten um und legen Sie sie zurück in den 21 °C warmen Inkubator. Verwenden Sie ein Fluoreszenzstereoskop mit einem GFP-Filterset. Zählen und notieren Sie die Anzahl der GFP-positiven und GFP-negativen Würmer auf den Objektträgern für jede Wiederholung mit Hilfe eines Zählzählers.HINWEIS: GFP-positive Würmer haben eine nukleäre GFP-Expression in ihrer Keimbahn und ihren Embryonen in utero. Die Keimbahnen von GFP-negativen Würmern fluoreszieren nicht, aber wenn das GFP in späteren Generationen wieder eingeschaltet wird, kann die Fluoreszenz schwach sein. Es kann hilfreich sein, zusätzliche nicht-transgene Wurmstämme zu montieren, um die beobachtete Autofluoreszenz zu berücksichtigen. Passage der Population durch Bleichen, wie oben beschrieben, etwa alle 4 Tage (96 h) bei 21 °C. Alternativ kann die Passage der Einfachheit halber nach einem abwechselnden 3-Tage-/4-Tage-Zeitplan durchgeführt werden. Teller mit zusätzlichen ~50 Embryonen für die kürzeren Populationen, wenn sie sich abwechseln, da es nach 72 Stunden zu einer geringeren Embryonenausbeute kommen kann.HINWEIS: Halten Sie die Durchlaufzeit der P0-Generation konstant bei 4 Tagen nach der Beschichtung der Embryonen. 4. Tiersammlung für ChIP HINWEIS: Die Anzahl der Tiere und der Zeitpunkt hängen vom Stamm, dem Entwicklungsstadium, dem Epitop und der Anzahl der Immunpräzipitationsziele (IP) ab. Sammeln Sie im folgenden Beispiel Tiere für drei IP-Adressen: H3K9me3, Histon H3 und IgG-Kontrolle. Das ChIP-Protokoll wurde von Askjaer et al.21 adaptiert. Erweitern Sie vor der ChIP-Probenentnahme die vorherige Generation des RNAi-Vererbungsassays um weitere drei NGM-Platten (auf mindestens vier Platten pro Replikation). 4 Tage lang bei 21 °C wachsen. Bleichen Sie die trächtigen Erwachsenen, um die Embryonen zu isolieren (siehe Schritt 2.3). Für jeden Stamm werden etwa 3.500 Embryonen auf 14 Platten (250 pro Platte) aufgetragen und 3 Tage lang bei 21 °C bis zum jungen Erwachsenenstadium heranwachsen. Waschen Sie die Tiere in 1,5-ml-Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 0,01 % (v/v) TX-100 (PBS/TX) enthält. Bei 1.000 x g für 2 min zentrifugieren. Die Tiere von einem Stamm in ein Röhrchen absaugen und zusammenlegen und drei weitere Male mit mindestens 1 ml PBS/TX waschen. Auf 1.000 μl absaugen, zum Mischen invertieren und die Anzahl der Tiere in 3 μl dreimal zählen (siehe Schritt 2.3.9). Berechnen Sie die Konzentration der Tiere und übertragen Sie ein Volumen, das 3.000 Tieren entspricht, zur Formaldehydvernetzung in ein neues Röhrchen. Achten Sie darauf, dass das Gesamtvolumen mindestens das 10-fache des Wurmpelletvolumens beträgt. 5. Formaldehyd-Vernetzung VORSICHT: Arbeiten Sie mit Formaldehyd in einem Abzug, um eine Dampfexposition zu vermeiden. Formaldehyd (1,8 % Endkonzentration) in das Röhrchen mit den Würmern geben. Bei Raumtemperatur 6 Min. drehen. Sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Das Experiment kann in diesem Schritt pausiert und die Proben bei -80 °C gelagert werden. Die vernetzte Probe wird in einem Wasserbad bei Raumtemperatur 3 min aufgetaut und 16 min bei Raumtemperatur gedreht. 1,25 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 mM zugeben und 5 min drehen.HINWEIS: Bewahren Sie die Proben bis zur magnetischen Bead-Elution auf Eis oder bei 4 °C auf und verwenden Sie eiskalte Puffer. Die Probe wird bei 1.000 x g für 3 min zentrifugiert. Dreimal mit jeweils 1 ml PBS/TX waschen. Zweimal mit 1 ml Resuspensionspuffer (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [PH 7,5], 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], 0,01 % TX-100, Proteaseinhibitor [eine Tablette pro 5 ml]) waschen. Lassen Sie nach der letzten Wäsche genügend Puffer, um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen mindestens das Dreifache des Pelletvolumens und mindestens ~100 μl beträgt. 6. Beschallung HINWEIS: Die Beschallungsparameter hängen von der Art und dem Modell des Beschallungsgeräts und der Tierstufe ab. Parameter wie Probenvolumen und -konzentration, Ein-/Ausschaltintervalle, Anzahl der Zyklen und Leistungseinstellung müssen empirisch optimiert werden. Überwachen Sie beispielsweise die Wurmlyse über einen bestimmten Zeitraum mit einem Proteinassay und bestimmen Sie, wann die Konzentration ein Plateau erreicht. Wenn die durchschnittliche Schergröße der genomischen DNA etwa 200-1.000 bp beträgt, ist außerdem durch Elektrophorese der DNA, die nach der Umkehrung der Vernetzung gereinigt wurde, auf einem 1,5%igen Agarose/Trisacetat-EDTA (TAE)-Gel zu überwachen. Messen Sie das Volumen der Proben aus dem vorherigen Schritt. Mischen und aliquotieren Sie 90-120 μl in ein Styropor-Beschallungsröhrchen. Geben Sie ein gleiches Volumen Resuspensionspuffer mit 2x Detergenzien (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [PH 7,5], 1 mM EDTA, 0,2 % Natriumdesoxycholat, 0,7 % Sarkosyl) hinzu. Beschallung in einem Wasserbad-Ultraschallgerät bei 50 % Leistung für 7 Minuten (20 s an/40 s aus) bei 4 °C. Durch Pipettieren vorsichtig mischen. Wiederholen Sie die Beschallung für weitere 7 Minuten. Überführen Sie das beschallte Lysat in ein 1,5-ml-Röhrchen. Geben Sie 0,5 Volumina Resuspensionspuffer ohne Detergenzien (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [PH 7,5], 1 mM EDTA) hinzu (z. B. 100 μl Puffer zu 200 μl Probe hinzufügen). Bei 13.000 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Behalten Sie den Lysatüberstand und geben Sie ihn in ein neues Röhrchen um. Führen Sie optional einen Proteinassay durch, um die Konzentrationen jedes Lysats zu bestimmen. Dieser Schritt kann für große Probenmengen oder Vergleiche zwischen den Assays nützlich sein. Die Standardisierung der Anzahl der Tiere, wie oben beschrieben, funktioniert jedoch gut für die hier beschriebenen Probenmengen, da eine bessere Korrelation mit der Ausbeute an Chromatin/DNA besteht, wie sie durch qPCR bestimmt wird. 7. Immunpräzipitation HINWEIS: Skalieren Sie die Menge der Antikörper und magnetischen Kügelchen auf das Volumen und die Konzentration des Lysats. Teilen Sie den Lysatüberstand in vier Portionen auf: drei gleiche Volumina für jede IP und 10 % des Volumens einer IP als Eingang (z. B. 100 μl IP #1, 100 μl IP #2, 100 μl IP #3, 10 μl Eingangs). Das IP-Lysat wird in ein 200-μl-PCR-Röhrchen überführt und bei -20 °C in einem 1,5-ml-Röhrchen gelagert. Geben Sie 0,5 μg Anti-H3K9me3-Antikörper, Anti-Histon-H3-Antikörper oder IgG in die entsprechende IP-Probe. Bei 4 °C über Nacht mit Rotation inkubieren. Am nächsten Tag werden 9 μl Protein-G-beschichtete Magnetkügelchen pro IP in ein einzelnes 1,5-ml-Röhrchen aliquotiert. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 ml FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [PH 7,5], 1 mM EDTA, 1 % TX-100, 0,1 % Natriumdesoxycholat). Resuspendieren Sie die magnetischen Kügelchen im FA-150-Puffer auf das ursprüngliche Volumen, das in Schritt 7.3 oben aus dem Material entnommen wurde. Fügen Sie 7,5 μl zu jeder IP hinzu. Bei 4 °C 2 h mit Rotation inkubieren. 8. Waschen und Elution HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die magnetischen Perlen nicht austrocknen, fügen Sie jede Wäsche oder jeden Elutionspuffer schnell nach dem Absaugen der vorherigen Wäsche hinzu. Verwenden Sie jedes Mal 0,2-1 ml der folgenden Pufferlösungen, um die Perlen zu waschen. Sammeln Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer, um die Wäsche abzusaugen. Jede Wäsche bei 4 °C für 5 Minuten mit Rotation inkubieren. Befolgen Sie die folgende Reihenfolge.Zweimal mit FA-150 waschen. Einmal mit FA-1M (FA-150 mit 1 M NaCl) waschen. Einmal mit FA-0,5M (FA-150 mit 0,5 M NaCl) waschen. In ein neues PCR-Röhrchen umfüllen. Einmal mit TE-LiCl waschen (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% Natriumdesoxycholat). Zweimal mit TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 0,005 % IGEPAL CA-630) waschen.HINWEIS: Setzen Sie die Probenverarbeitung bei Raumtemperatur fort, sofern nicht anders angegeben. Saugen Sie den letzten Waschpuffer an. Die magnetischen Kügelchen werden mit 50 μl ChIP-Elutionspuffer (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1 % Natriumdodecylsulfat [SDS]) resuspendiert und in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt. Bei 65 °C für 15 min in einem Thermomischer mit Mischen bei 1.000 U/min für 5 s pro Minute eluieren. Sammeln Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer und geben Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Wiederholen Sie die Elution mit weiteren 50 μl ChIP-Elutionspuffer. Fassen Sie die Überstände für insgesamt 100 μl zusammen. Fahren Sie mit der umgekehrten Vernetzung und DNA-Elution fort, wie unten beschrieben. 9. Reverse Crosslinking und DNA-Elution Tauen Sie die Eingangslysatprobe auf. Bis zu 100 μl mit ChIP-Elutionspuffer auffüllen. Fügen Sie 16,5 μg RNase A zu jeder IP- und Eingangsprobe hinzu. 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. 40 μg Proteinase K zugeben und bei 55 °C für 2 h inkubieren. Anschließend über Nacht bei 65 °C inkubieren. Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur ab und reinigen Sie die DNA mit einem Spin-Säulen-Kit. 10. Aufbau und Ablauf der qPCR-Reaktion HINWEIS: Die Parameter des Primers, des Reaktionsaufbaus und des Thermocyclers sollten so geändert werden, dass sie den Empfehlungen des Herstellers für die verwendete qPCR-Reaktionsmischung entsprechen. Bereiten Sie Primer-Sets vor, die auf den GFP-RNAi-Reporter und die positiven und negativen Anreicherungskontrollregionen von H3K9me3 abzielen. Die Schmelztemperatur der Grundierung beträgt 60 °C. Siehe Materialtabelle für Primer-Sequenzen. Für die Eingangs-DNA werden vier vierfache serielle Verdünnungen vorgenommen (z. B. 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).ANMERKUNG: Die IP-DNA kann direkt oder verdünnt (z. B. 1:2 oder 1:3) verwendet werden, um mehr Reaktionen zu ermöglichen. Die Eignung der Verdünnung muss empirisch bestimmt werden, da die qPCR-Leistung beeinträchtigt werden kann. Organisieren Sie alle Reaktionen, die einem Primer-Set entsprechen, auf einer PCR-Platte. Richten Sie technische Duplikatreaktionen für jede Eingangs-DNA-Verdünnung und jede IP-DNA-Probe ein. Jede 10-μl-Reaktion enthält 1,5 μl Eingangs- oder IP-DNA (oder Elutionspuffer als Kontrolle), qPCR-Mastermix (1-fache Endkonzentration), Vorwärtsprimer und Reverse-Primer (400 nM Endkonzentration für jeden Primer). Führen Sie auf einem Echtzeit-Thermocycler das folgende Programm aus: anfängliche Denaturierung: 95 °C für 4 min; Amplifikation und Fluoreszenzdetektion: 40 Zyklen von 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s mit einem Plate-Read; Endausdehnung: 60 °C für 5 min; Schmelzekurve: von 60 °C bis 90 °C in Schritten von 0,5 °C, 5 s pro Schritt. 11. Bestimmung der Amplifikationseffizienz und Überprüfung der Produktspezifität Zeichnen Sie für jeden Satz von Eingangs-DNA-Verdünnungen die vier Datenpunkte mit [log10(1/dilution)] auf der x-Achse und [Eingabe-Cq] auf der y-Achse auf. Bestimmen Sie die Steigung der Linie mit der besten Anpassung. Berechnen Sie die Verstärkungseffizienz. Ideale Primer-Sets sollten konstant einen Wirkungsgrad von 95 % bis 100 % aufweisen. Stellen Sie sicher, dass alle Reaktionen eine scharfe Schmelzkurvenspitze aufweisen und dass Reaktionen mit demselben Primersatz die gleiche Schmelztemperatur haben. Mehrere Peaks oder unterschiedliche Schmelztemperaturen können auf eine unspezifische Verstärkung hinweisen. Optional können Reaktionen auf einem Standard-Gel mit 2 % Agarose/TAE bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um die Bandengröße des Produkts zu überprüfen. 12. Berechnung des Prozentsatzes des Inputs Berechnen Sie den Eingangsverdünnungsfaktor. Da 10 % des IP-Lysatvolumens als Input gespeichert wurden, beträgt der Verdünnungsfaktor für die 1:5-Verdünnung der Input-DNA 50. Bestimmen Sie den IP-Verdünnungsfaktor. Wenn die IP-DNA vor der qPCR nicht verdünnt wird, beträgt der Verdünnungsfaktor 1. Berechnen Sie die Cq-Differenz zwischen IP und Input, bereinigt um Verdünnungsfaktoren. Berechnen Sie den Prozentsatz der Eingabe.