Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

NOTA: En la Figura 1 se proporciona un cronograma de ensayo. 1. Preparación de placas de medio de crecimiento de nematodos ARNi (RNAi-NGM) Eliminar E. coli HT115(DE3) que contiene GFP o vectores de ARNi de control de las existencias de glicerol en placas de agar Luria-Bertani (LB) suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina. Incubar las bacterias durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, prepare placas de ARNi-NGM (agar al 1,7% [p/v], NaCl al 0,3% [p/v], peptona al 0,25% [p/v], 1 mM de CaCl2, 5 μg/ml de colesterol, tampón fosfato de potasio 25 mM [pH 6,0], 1 mM de MgSO4, 25 μg/ml de carbenicilina y 5 mM de isopropilo β-d-1-tiogalactopiranósido [IPTG]) de acuerdo con el protocolo estándar18.Para cada cepa del ensayo, prepare un mínimo de seis placas de ARNi-NGM sembradas con ARNi GFP (dos placas para cada una de las tres réplicas biológicas) y dos placas de ARNi-NGM sembradas con ARNi de control (una réplica biológica). Cubra los platos sin apretar con papel de aluminio para protegerlos de la luz y déjelos secar durante la noche a temperatura ambiente. El mismo día del vertido de la placa de ARNi-NGM, prepare 4 ml de cultivos líquidos de bacterias ARNi.En condiciones estériles, alícuota 4 mL de caldo LB suplementado con 10 μg/mL de tetraciclina y 100 μg/mL de ampicilina en tubos de cultivo. Recoger colonias individuales de las placas de agar LB en cada tubo e incubar durante la noche agitando durante aproximadamente 16 h a 37 °C. Siembra de bacterias de ARNi en las placas de ARNi-NGM.Después del crecimiento durante la noche, mida la densidad óptica (OD600) de los cultivos utilizando una dilución 1:5 de bacterias con caldo LB. Diluir las bacterias de ARNi a un OD relativo de 600 de 2 utilizando caldo LB suplementado con 10 μg/mL de tetraciclina y100 μg/mL de ampicilina. En condiciones estériles, añadir 150 μL de la bacteria de control o de ARNi GFP en cada placa de ARNi-NGM. Cubra las placas con papel de aluminio y deje que las bacterias crezcan durante al menos 24 horas a temperatura ambiente antes de usarlas.NOTA: Las placas de RNAi-NGM no utilizadas pueden almacenarse invertidas hasta 1 semana a 4 °C en un recipiente sellado a oscuras. 2. Inicio del ensayo de herencia de ARNi: blanqueo y siembra de embriones para la generación P0 NOTA: Antes de comenzar el ensayo de herencia de ARNi, los gusanos que contienen el reportero de GFP mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3’UTR]7 deben mantenerse sin inanición a 21 °C durante al menos dos generaciones. A los 4 días (96 h) antes del inicio del ensayo de herencia de ARNi (Figura 1), se recogen tres o cuatro adultos grávidos en cada placa NGM estándar de 35 mm sembrada con la bacteria OP50-1.NOTA: Tres placas NGM por cepa son suficientes. En el caso de cepas con fertilidad comprometida, es posible que se requieran más de cuatro animales por placa. Después de 4 días, asegúrese de que la población adulta haya comenzado a poner embriones en la placa. Lave los gusanos de las placas en tubos de 1,5 ml utilizando 800 μl de tampón M9 suplementado con Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl,1 mM MgSO 4, 0,01% (v/v) TX-100). Repita el lavado y la piscina en el mismo tubo. Aislar los embriones de la población mediante blanqueamiento de la siguiente manera.Prepare una solución blanqueadora con lejía (hipoclorito de sodio al 6%) y 10 N NaOH en una proporción de volumen de 1,5:1. Preparar una cantidad suficiente para que se puedan utilizar 250 μL por cada muestra. Centrifugar los tubos de 1,5 ml con los gusanos a 1.000 x g durante 1,5-2 min. Aspirar el sobrenadante, dejando 100 μL sin alterar el “pellet” del gusano. Alternativamente, los tubos se pueden dejar durante aproximadamente 2 minutos para permitir que los gusanos se asienten antes de aspirar. Añadir 650 μL de ddH2O a cada tubo para conseguir un volumen final de 750 μL.NOTA: Los siguientes pasos son urgentes. Agregue 250 μL de la solución blanqueadora a cada tubo y ponga en marcha un temporizador. Cada 1-2 minutos, haga un vórtice de los tubos a fondo. Después de 5 minutos, revise los gusanos bajo el estereoscopio para monitorear la degradación de los adultos. Continúe el vórtice hasta que los gusanos se disuelvan por completo y solo queden embriones. Centrifugar inmediatamente los tubos a 1.000 x g durante 1,5 min.NOTA: El blanqueamiento generalmente se completa en 6-7 minutos, pero debe controlarse con un estereoscopio a un aumento suficiente para observar los embriones liberados (40x). No dejes los gusanos en lejía durante un período prolongado, ya que esto comprometerá los embriones. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y dejar aproximadamente 50-100 μL. Añadir 1 mL de tampón M9 con TX-100 para lavar y mezclar por vórtice. Centrifugar de nuevo a 1.000 x g durante 1,5-2 minutos y lavar al menos dos veces más. Aspirar el sobrenadante del lavado final y dejar aproximadamente 100 μL en el tubo. Mezclar por vórtice. Pipetear 2 μL de cada tubo dos veces en un portaobjetos de vidrio etiquetado. Cuente los embriones usando un contador de conteo para estimar la concentración de embriones por microlitro.NOTA: Los portaobjetos con múltiples pocillos esmerilados se pueden usar aquí para contar réplicas de múltiples cepas. Los portaobjetos de conteo se pueden lavar y reutilizar. Para iniciar un crecimiento poblacional semisincronizado, mezcle y pipetee un volumen que contenga 250 embriones en cada placa de ARNi-NGM. Utilice dos placas para cada réplica. Deja que el líquido se absorba. Para la generación P0 tratada con ARNi, incubar a 21 °C durante 4 días (96 h) (desde los embriones hasta la edad adulta). Los tiempos pueden variar según el genotipo. Figura 1: Esquema del ensayo de herencia de ARNi. Cronograma propuesto para la preparación de placas de ARNi-NGM y la configuración del ensayo de herencia de ARNi. Los adultos grávidos se recogen en el día -4 en placas NGM sembradas con OP50-1. Después de 4 días, la progenie adulta se blanquea y los embriones se siembran en placas de ARNi-NGM. La generación de P0 se expone al ARNi durante 4 días a 21 °C. Una vez que los gusanos alcanzan la edad adulta, las réplicas son pasadas por blanqueamiento y puntuadas para la expresión de GFP de la línea germinal en cada generación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Pasar y puntuar cada generación para la expresión de GFP de la línea germinal NOTA: Para facilitar la puntuación, use un disco de vinilo para crear almohadillas de agarosa con crestas lineales para alinear los gusanos. Este método fue adaptado de Rivera Gómez y Schvarzstein19. Preparar agarosa al 1% (p/v) disolviendo agarosa en ddH2O en un matraz pequeño calentando en el microondas. Agregue una barra para revolver y cubra con papel de aluminio. Si se vuelve a fundir, caliente la agarosa en una placa calefactora a 200 °C mientras revuelve. Una vez derretido, reduzca el fuego a 80 °C. Lave los gusanos de las placas NGM con 800 μL de tampón M9 con TX-100 en un tubo de 1,5 mL. Lave los platos dos veces para eliminar todos los adultos grávidos. Revise las placas debajo del estereoscopio para confirmar que los animales se han recolectado de manera eficiente. Centrifugar los tubos a 1.000 x g durante 1,5-2 minutos o dejar que las lombrices se asienten durante 2 minutos. Aspirar el sobrenadante y dejar 100 μL sin alterar el ‘pellet’ del gusano. Prepare las almohadillas de agarosa para montar los gusanos de la siguiente manera.Coloque una gota de agarosa derretida al 1% (p/v) en el disco de vinilo (descrito anteriormente19) con una pipeta Pasteur de vidrio (con el extremo estrecho roto). Oriente una diapositiva de vidrio de modo que las líneas del disco sean horizontales o verticales y coloque la diapositiva rápidamente sobre la gota de agarosa. Espere aproximadamente 30 segundos antes de retirar la diapositiva de vidrio del disco.NOTA: Si marca varios genotipos, puede ser útil hacer una almohadilla de agarosa más grande en un portaobjetos y cortarla por la mitad con una cuchilla. Monta los gusanos en las almohadillas de agarosa.Bajo el estereoscopio, agregue aproximadamente 5 μL de 5 mM de levamisol a la almohadilla de agarosa. La dilución de levamisol debe hacerse nueva cada semana. Agite suavemente los tubos de lombrices para mezclar y transfiera 5-10 μL de lombrices a la almohadilla de agarosa. Calcule el número de gusanos a ojo a medida que se van añadiendo, de modo que haya aproximadamente 40 gusanos por réplica. Alinee los gusanos en filas con un palillo de pestañas para marcar más fácilmente. Añade un cubreobjetos de vidrio.NOTA: Los portaobjetos con animales montados de esta manera pueden durar varias horas antes de secarse. Aísle los embriones de los animales restantes utilizando el protocolo de blanqueamiento (consulte el paso 2.3) antes de marcar los portaobjetos. Colocar 250 embriones en placas NGM de 35 mm sembradas con OP50-120. Una vez absorbido el líquido, invierta las placas y devuélvalas a la incubadora a 21 °C. Utilice un estereoscopio de fluorescencia con un conjunto de filtros GFP. Cuente y registre el número de gusanos positivos y negativos de GFP en las diapositivas de cada réplica utilizando un contador de recuento.NOTA: Los gusanos GFP positivos tendrán expresión nuclear de GFP en su línea germinal y embriones en el útero. Las líneas germinales de los gusanos GFP negativos no serán fluorescentes, sin embargo, a medida que la GFP comienza a volver a activarse en generaciones posteriores, la fluorescencia puede ser tenue. Puede ser útil montar cepas adicionales de gusanos no transgénicos para tener en cuenta cualquier autofluorescencia observada. Pasar la población por blanqueamiento, como se ha descrito anteriormente, aproximadamente cada 4 días (96 h) a 21 °C. Alternativamente, el pase se puede hacer en un horario alterno de 3 días / 4 días para mayor comodidad. Coloque ~ 50 embriones adicionales para las generaciones de paso más cortas si se alternan, ya que puede haber un menor rendimiento de embriones después de 72 h.NOTA: Mantenga constante el tiempo de paso de la generación P0 a los 4 días después de la siembra de los embriones. 4. Recogida de animales para ChIP NOTA: El número de animales y el momento dependen de la cepa, la etapa de desarrollo, el epítopo y el número de objetivos de inmunoprecipitación (IP). En el siguiente ejemplo, recoja animales para tres IP: H3K9me3, histona H3 y control de IgG. El protocolo ChIP fue adaptado de Askjaer et al.21. Antes de la recolección de muestras de ChIP, amplíe la generación anterior del ensayo de herencia de ARNi con tres placas NGM adicionales (a al menos cuatro placas por réplica). Cultivar durante 4 días a 21 °C. Blanquear los adultos grávidos para aislar los embriones (consulte el paso 2.3). Para cada cepa, coloque aproximadamente 3.500 embriones en 14 placas (250 por placa) y crezca durante 3 días a 21 °C hasta la etapa de adulto joven. Lavar a los animales en tubos de 1,5 ml con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0,01% (v/v) de TX-100 (PBS/TX). Centrifugar a 1.000 x g durante 2 min. Aspire y agrupe a los animales de una cepa en un tubo y lávelos tres veces más con al menos 1 ml de PBS/TX. Aspirar a 1.000 μL, invertir para mezclar y contar el número de animales en 3 μL tres veces (consulte el paso 2.3.9). Calcular la concentración de animales y transferir un volumen correspondiente a 3.000 animales a un nuevo tubo para la reticulación de formaldehído. Asegúrese de que el volumen total sea al menos 10 veces el volumen de gránulos de gusano. 5. Reticulación de formaldehído PRECAUCIÓN: Trabaje con formaldehído en una campana extractora para evitar la exposición al vapor. Agregue formaldehído (1,8% de concentración final) al tubo que contiene los gusanos. Gire a temperatura ambiente durante 6 min. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido. El experimento se puede pausar en este paso y las muestras se pueden almacenar a -80 °C. Descongele la muestra reticulada en un baño de agua a temperatura ambiente durante 3 minutos y gírela durante 16 minutos a temperatura ambiente. Añadir 1,25 M de glicina a una concentración final de 125 mM y girar durante 5 min.NOTA: Hasta la elución magnética de las perlas, mantenga las muestras en hielo o a 4 °C y utilice tampones helados. Centrifugar la muestra a 1.000 x g durante 3 min. Lávese tres veces con 1 ml de PBS/TX cada vez. Lavar dos veces con 1 mL de tampón de resuspensión (150 mM de NaCl, 50 mM DE HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético [EDTA], 0,01% TX-100, inhibidor de la proteasa [un comprimido por 5 mL]). Después del último lavado, deje suficiente tampón para garantizar que el volumen total sea al menos tres veces el volumen del gránulo y un mínimo de ~ 100 μL. 6. Sonicación NOTA: Los parámetros de sonicación dependen del tipo y modelo de sonicador y de la fase animal. Parámetros como el volumen y la concentración de la muestra, los intervalos de encendido/apagado, el número de ciclos y el ajuste de potencia deben optimizarse empíricamente. Por ejemplo, durante un período de tiempo de sonicación, monitorizar la lisis de los gusanos mediante un ensayo de proteínas y determinar cuándo la concentración alcanza una meseta. Además, monitorizar cuando el tamaño medio de cizallamiento del ADN genómico es de aproximadamente 200-1.000 pb mediante electroforesis del ADN, purificado tras la reversión de la reticulación, en un gel de agarosa/tris-acetato-EDTA (TAE) al 1,5%. Mida el volumen de muestras del paso anterior. Mezclar y alícuota 90-120 μL a un tubo de sonicación de poliestireno. Añadir un volumen igual de tampón de resuspensión que contenga 2 detergentes (150 mM de NaCl, 50 mM DE HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM de EDTA, 0,2% de desoxicolato de sodio, 0,7% de sarkosil). Sonicado en un sonicador en baño de agua al 50% de potencia durante 7 min (20 s encendido/40 s apagado) a 4 °C. Mezclar suavemente pipeteando. Repita la sonicación durante 7 minutos más. Transfiera el lisado sonicado a un tubo de 1,5 ml. Añadir 0,5 volúmenes de tampón de resuspensión sin detergentes (150 mM de NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM de EDTA) (p. ej., añadir 100 μL de tampón a 200 μL de muestra). Centrifugar a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C. Mantenga el lisado sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo. Opcionalmente, realice un ensayo de proteínas para determinar las concentraciones de cada lisado. Este paso puede ser útil para grandes cantidades de muestras o comparaciones entre ensayos. Sin embargo, la estandarización del número de animales como se ha descrito anteriormente funciona bien para las cantidades de muestra descritas aquí, ya que existe una mejor correlación con el rendimiento de cromatina/ADN determinado por qPCR. 7. Inmunoprecipitación NOTA: Ajuste la cantidad de anticuerpos y perlas magnéticas al volumen y la concentración de lisado. Divida el sobrenadante de lisado en cuatro porciones: tres volúmenes iguales para cada IP y el 10% del volumen de una IP como entrada (por ejemplo, 100 μL de IP #1, 100 μL de IP #2, 100 μL de IP #3, 10 μL de entrada). Transfiera el lisado IP a un tubo de PCR de 200 μL y almacene el lisado de entrada a -20 °C en un tubo de 1,5 ml. Añadir 0,5 μg de anticuerpo anti-H3K9me3, anticuerpo antihistona H3 o IgG a la muestra IP adecuada. Incubar a 4 °C durante la noche con rotación. Al día siguiente, alícuota 9 μL de perlas magnéticas recubiertas de proteína G por IP a un solo tubo de 1,5 mL. Lave las perlas dos veces con 1 mL de FA-150 (150 mM de NaCl, 50 mM DE HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM de EDTA, 1% de TX-100, 0,1% de desoxicolato de sodio). Vuelva a suspender las perlas magnéticas en el tampón FA-150 al volumen original tomado del stock en el paso 7.3 anterior. Agregue 7,5 μL a cada IP. Incubar a 4 °C durante 2 h con rotación. 8. Lavados y elución NOTA: Para asegurarse de que las perlas magnéticas no se sequen, agregue cada tampón de lavado o elución rápidamente después de aspirar el lavado anterior. Use 0.2-1 mL de las siguientes soluciones tampón cada vez para lavar las perlas. Recoja las perlas en un soporte magnético para aspirar los lavados. Incubar cada lavado a 4 °C durante 5 min con rotación. Siga el orden que se indica a continuación.Lavar dos veces con FA-150. Lavar una vez con FA-1M (FA-150 con NaCl 1 M). Lavar una vez con FA-0,5M (FA-150 con NaCl 0,5 M). Transfiéralo a un nuevo tubo de PCR. Lavar una vez con TE-LiCl (250 mM de LiCl, 10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM de EDTA, 1% de IGEPAL CA-630, 1% de desoxicolato de sodio). Lavar dos veces con TE+ (50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM de EDTA, 0,005% de IGEPAL CA-630).NOTA: Continúe el procesamiento de la muestra a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Aspire el último tampón de lavado. Vuelva a suspender las perlas magnéticas con 50 μL de tampón de elución ChIP (200 mM de NaCl, 10 mM de Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM de EDTA, 1% de dodecil sulfato de sodio [SDS]) y transfiéralas a un tubo de 1,5 mL. Eluir a 65 °C durante 15 min en una termomezcladora mezclando a 1.000 rpm durante 5 s cada minuto. Recoja las cuentas en un soporte magnético y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Repita la elución con otros 50 μL de tampón de elución ChIP. Agrupe los sobrenadantes para un total de 100 μL. Proceda a la reticulación inversa y a la elución del ADN, como se detalla a continuación. 9. Reticulación inversa y elución del ADN Descongele la muestra de lisado de entrada. Rellene hasta 100 μL con tampón de elución ChIP. Agregue 16,5 μg de RNasa A a cada IP y muestra de entrada. Incubar a 37 °C durante 1 h. Añadir 40 μg de Proteinasa K e incubar a 55 °C durante 2 h. A continuación, incubar a 65 °C durante la noche. Enfríe las muestras a temperatura ambiente y purifique el ADN con un kit de columna de centrifugación. 10. Configuración y ejecución de la reacción de qPCR NOTA: El cebador, la configuración de la reacción y los parámetros del termociclador deben modificarse para que coincidan con las recomendaciones del fabricante para la mezcla de reacción de qPCR en uso. Prepare conjuntos de cebadores dirigidos al reportero de ARNi de GFP y a las regiones de control de enriquecimiento positivo y negativo de H3K9me3. La temperatura de fusión de la imprimación es de 60 °C. Consulte la Tabla de materiales para ver las secuencias de cebadores. Para el ADN de entrada, realice cuatro diluciones en serie cuádruples (por ejemplo, 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).NOTA: El ADN IP puede usarse directamente o diluido (por ejemplo, 1:2 o 1:3) para permitir más reacciones. La idoneidad de la dilución debe determinarse empíricamente, ya que el rendimiento de la qPCR puede verse afectado. Organice todas las reacciones correspondientes a un conjunto de cebadores en una placa de PCR. Configure reacciones técnicas duplicadas para cada dilución de ADN de entrada y cada muestra de ADN IP. Cada reacción de 10 μL contiene 1,5 μL de ADN de entrada o IP (o tampón de elución como control), mezcla maestra de qPCR (1x concentración final), cebador directo y cebador inverso (concentración final de 400 nM para cada cebador). En un termociclador en tiempo real, ejecute el siguiente programa: desnaturalización inicial: 95 °C durante 4 min; detección de amplificación y fluorescencia: 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s con lectura de placa; extensión final: 60 °C durante 5 min; Curva de fusión: de 60 °C a 90 °C en incrementos de 0,5 °C, 5 s por paso. 11. Determinación de la eficiencia de amplificación y verificación de la especificidad del producto Para cada conjunto de diluciones de ADN de entrada, represente los cuatro puntos de datos con [log10(1/dilución)] en el eje x y [Input Cq] en el eje y. Determine la pendiente de la línea de mejor ajuste. Calcule la eficiencia de amplificación. Los juegos de imprimación ideales deben mostrar constantemente una eficiencia del 95% al 100%. Compruebe que todas las reacciones tengan un pico de curva de fusión pronunciada y que las reacciones con el mismo juego de cebadores tengan la misma temperatura de fusión. Múltiples picos o diferentes temperaturas de fusión pueden indicar una amplificación no específica. Opcionalmente, ejecute las reacciones en un gel estándar de agarosa/TAE al 2% a temperatura ambiente para verificar el tamaño de la banda del producto. 12. Cálculo del porcentaje de entrada Calcule el factor de dilución de entrada. Dado que el 10% del volumen de lisado de IP se guardó como entrada, el factor de dilución para la dilución 1:5 del ADN de entrada es 50. Determine el factor de dilución IP. Si el ADN IP no se diluye antes de la qPCR, entonces el factor de dilución es 1. Calcule la diferencia de Cq entre el IP y la entrada ajustada por factores de dilución. Calcule el porcentaje de entrada.