Анализ трансгенерационного эпигенетического наследования C. elegans с использованием флуоресцентного репортера и хроматиновой иммунопреципитации (ChIP)

ПРИМЕЧАНИЕ: График анализа представлен на рисунке 1. 1. Приготовление планшетов из питательной среды для РНК-интерференционной нематоды (РНК-интерференционная среда для выращивания нематод) E. coli HT115(DE3), содержащий векторы GFP или контрольной РНК-интерференции, из глицериновых запасов на агаровые пластины Лурии-Бертани (LB) с добавлением ампициллина в дозе 100 мкг/мл. Инкубируйте бактерии в течение ночи при температуре 37 °C. На следующий день готовят планшеты RNAi-NGM (1,7% [масс./об.] агар, 0.3% [масс./об.] NaCl, 0.25% [масс./об.] пептон, 1 мМ CaCl2, 5 мкг/мл холестерина, 25 мМ калийфосфатного буфера [рН 6,0], 1 мМ MgSO4, 25 мкг/мл карбенициллина и 5 мМ изопропилового β-d-1-тиогалактопиранозида [IPTG]) в соответствии со стандартным протоколом18.Для каждого штамма в анализе подготовьте как минимум шесть планшетов РНК-интерференции с РНК-интерференцией GFP (по две пластины для каждого из трех биологических репликатов) и две пластины РНК-интерференции с контрольной РНК-интерференцией (один биологический репликат). Неплотно накройте тарелки фольгой, чтобы защитить от света, и оставьте на ночь при комнатной температуре для высыхания. В тот же день, что и заливка планшета РНК-интерференцией, приготовьте 4 мл жидких культур РНК-интерференции.В стерильных условиях аликвотные 4 мл бульона LB с добавлением 10 мкг/мл тетрациклина и 100 мкг/мл ампициллина в культуральные пробирки. Соберите отдельные колонии из агаровых пластин LB в каждую пробирку и инкубируйте в течение ночи при встряхивании в течение примерно 16 ч при 37 °C. Поместите РНК-интерференционные бактерии на пластины РНК-интерференции.После ночного роста измерьте оптическую плотность (OD600) культур, используя разбавление бактерий бульоном LB в соотношении 1:5. Разбавляют РНК-интерференционные бактерии до относительного OD 600 из 2 с помощью бульона LB, добавленного 10 мкг/мл тетрациклина и100 мкг/мл ампициллина. В стерильных условиях добавьте 150 мкл контрольных или GFP РНК-интерференционных бактерий на каждую пластину RNAi-NGM. Перед использованием накройте пластины фольгой и дайте бактериям расти не менее 24 часов при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: Неиспользованные планшеты RNAi-NGM можно хранить в перевернутом виде до 1 недели при температуре 4 °C в закрытом контейнере в темноте. 2. Начало анализа наследования РНК-интерференции: обесцвечивание и покрытие эмбрионов поколения P0 ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом анализа наследования РНК-интерференции черви, содержащие репортер GFP mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3’UTR]7 , должны содержаться без голодания при температуре 21 °C в течение, по крайней мере, двух поколений. За 4 дня (96 ч) до начала анализа наследования РНК-интерференции (рис. 1) на каждую 35-миллиметровую стандартную пластину NGM, засеянную бактериями OP50-1, высаживают три или четыре взрослых особи гравида на каждую 35-миллиметровую пластину NGM.ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно трех пластин NGM на штамм. Для штаммов с пониженной фертильностью может потребоваться более четырех животных на тарелку. Через 4 дня убедитесь, что взрослая популяция начала откладывать эмбрионы на пластину. Смыть червей с планшетов в пробирки по 1,5 мл, используя 800 мкл буфера M9 с добавлением Triton X-100 (TX-100) (22 мМ KH 2 PO 4, 42 мМ Na2HPO 4, 86 мМ NaCl,1 мМ MgSO 4, 0,01% (v/v) TX-100). Повторите стирку и смешайте в той же пробирке. Изолируют эмбрионы от популяции путем отбеливания следующим образом.Приготовьте отбеливающий раствор с отбеливателем (6% гипохлорит натрия) и 10 N NaOH в объемном соотношении 1,5:1. Подготовьте достаточное количество, чтобы можно было использовать 250 мкл для каждого образца. Центрифугируют пробирки объемом 1,5 мл с червями при концентрации 1 000 x g в течение 1,5-2 мин. Отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя 100 мкл, не нарушая «гранулы» червя. В качестве альтернативы пробирки можно оставить примерно на 2 минуты, чтобы черви успокоились перед аспирацией. Добавьте 650 мкл ddH2O в каждую пробирку, чтобы получить окончательный объем 750 мкл.ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги чувствительны ко времени. Добавьте 250 мкл отбеливающего раствора в каждую пробирку и запустите таймер. Каждые 1-2 минуты тщательно прокручивайте трубки. Через 5 мин проверьте глистов под стереоскопом, чтобы проследить за деградацией взрослых особей. Продолжайте вихрь до тех пор, пока черви полностью не растворятся и не останутся только эмбрионы. Немедленно центрифугируйте пробирки при концентрации 1 000 x g в течение 1,5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Обесцвечивание, как правило, завершается в течение 6-7 минут, но должно контролироваться под стереоскопом при увеличении, достаточном для наблюдения за выпущенными эмбрионами (40x). Не оставляйте червей в отбеливателе на длительное время, так как это может поставить под угрозу эмбрионы. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и оставьте примерно 50-100 мкл. Добавьте 1 мл буфера M9 с TX-100 для промывки и перемешивания путем вихряния. Снова центрифугируйте при 1 000 x g в течение 1,5-2 мин и промойте еще не менее двух раз. Отсасывайте надосадочную жидкость из окончательной промывки и оставьте примерно 100 мкл в пробирке. Перемешиваем вихревым способом. Пипетку по 2 мкл из каждой пробирки дважды на предметное стекло с этикеткой. Подсчитайте эмбрионы с помощью счетчика, чтобы оценить концентрацию эмбрионов на микролитр.ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды с несколькими морозными лунками могут быть использованы здесь для подсчета репликаций нескольких штаммов. Подсчитывающие предметные стекла можно мыть и использовать повторно. Чтобы начать полусинхронизированный рост популяции, смешайте и пипетируйте объем, содержащий 250 эмбрионов, на каждую пластину RNAi-NGM. Используйте две пластины для каждой репликации. Дайте жидкости впитаться. Поколение P0, обработанное РНК-интерференцией, инкубируют при 21 °C в течение 4 дней (96 ч) (от эмбрионов до взрослого возраста). Сроки могут варьироваться в зависимости от генотипа. Рисунок 1: Схема анализа наследования РНК-интерференции. Предлагаемый график подготовки планшетов RNAi-NGM и настройки анализа наследования РНК-интерференции. Взрослые особи высевают на 4-й день на тарелки NGM, засеянные OP50-1. Через 4 дня взрослое потомство отбеливают, а эмбрионы помещают на планшеты RNAi-NGM. Поколение P0 подвергается воздействию РНК-интерференции в течение 4 дней при 21 °C. Как только черви достигают зрелого возраста, репликанты пассируются путем обесцвечивания и оцениваются на экспрессию GFP зародышевой линии в каждом поколении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. 3. Пассаж и оценка экспрессии GFP в каждом поколении зародышевой линии ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить подсечку, используйте виниловую пластинку для создания агарозных подушечек с линейными гребнями, чтобы выровнять червей. Этот метод был заимствован у Риверы Гомеса и Шварцштейна19. Приготовьте 1%-ную агарозу, растворив агарозу в ddH2Oв небольшой колбе путем нагревания в микроволновой печи. Добавьте перемешиватель и накройте фольгой. При переплавке нагрейте агарозу на конфорке при температуре 200 °C при перемешивании. После расплавления уменьшите огонь до 80 °C. Смойте червей с планшетов NGM с помощью 800 мкл буфера M9 с TX-100 в пробирку объемом 1,5 мл. Вымойте тарелки дважды, чтобы удалить все взрослые особи. Проверьте пластины под стереоскопом, чтобы убедиться, что животные были собраны эффективно. Центрифугируйте пробирки при концентрации 1 000 x g в течение 1,5-2 мин или дайте червям отстояться в течение 2 минут. Отсасывайте надосадочную жидкость и оставляйте 100 мкл, не нарушая «гранулы» червя. Подготовьте агарозные подушечки для крепления червей следующим образом.Поместите каплю расплавленной 1%-ной агарозы на виниловую пластинку (описанную выше19) с помощью стеклянной пипетки Пастера (с отломанным узким концом). Сориентируйте предметное стекло так, чтобы линии на пластинке были горизонтальными или вертикальными, и быстро поместите предметное стекло на каплю агарозы. Подождите примерно 30 секунд, прежде чем снимать предметное стекло с пластинки.ПРИМЕЧАНИЕ: При оценке нескольких генотипов может быть полезно сделать большую агарозную подушечку на одном предметном стекле и разрезать ее пополам с помощью лезвия. Установите червей на агарозные подушечки.Под стереоскопом добавьте примерно 5 мкл 5 мМ левамизола в агарозную подушечку. Разбавление левамизола следует делать свежим каждую неделю. Осторожно перемешайте пробирки с червями и перенесите 5-10 мкл червей на агарозную подушечку. Оцените количество червей на глаз по мере их добавления, чтобы на одну реплику приходилось примерно 40 червей. Выровняйте червей в ряды, используя насадку для ресниц для облегчения подрезки. Добавьте стеклянный покровный листок.ПРИМЕЧАНИЕ: Горки с животными, установленными таким образом, могут прослужить несколько часов, прежде чем высохнут. Изолируйте эмбрионы от остальных животных, используя протокол отбеливания (см. шаг 2.3), прежде чем ставить баллы на предметных стеклах. Планшет 250 эмбрионов на 35-миллиметровые планшеты NGM, засеянные OP50-120. Как только жидкость впитается, переверните пластины и верните их в инкубатор с температурой 21 °C. Используйте флоресцентный стереоскоп с набором фильтров GFP. Подсчитайте и запишите количество GFP-положительных и GFP-отрицательных червей на предметных стеклах для каждой репликации с помощью счетчика подсчета.ПРИМЕЧАНИЕ: GFP-положительные черви будут иметь ядерную экспрессию GFP в своей зародышевой линии и эмбрионы в утробе матери. Зародышевые линии GFP-отрицательных червей не флуоресцируют, однако, когда GFP начинает снова включаться в более поздних поколениях, флуоресценция может быть тусклой. Может быть полезно установить дополнительные нетрансгенные штаммы червей, чтобы учесть любую наблюдаемую автофлуоресценцию. Проходите популяцию путем отбеливания, как описано выше, примерно каждые 4 дня (96 ч) при 21 °C. Кроме того, для удобства пассирование может осуществляться по чередующемуся 3-дневному и 4-дневному графику. Добавьте ~50 эмбрионов для более коротких поколений, если они чередуются, так как после 72 ч может быть более низкий выход эмбрионов.ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы время пассажа поколения P0 оставалось неизменным на уровне 4 дней после нанесения эмбрионов на пластину. 4. Сбор животных для ЦИП ПРИМЕЧАНИЕ: Количество животных и сроки их содержания зависят от штамма, стадии развития, эпитопа и количества мишеней для иммунопреципитации (ВП). В приведенном ниже примере соберите животных по трем IP: H3K9me3, гистон H3 и контрольный IgG. Протокол ChIP был адаптирован из Askjaer et al.21. Перед сбором образцов ChIP расширьте предыдущее поколение анализа наследования РНК-интерференции еще тремя планшетами NGM (по крайней мере, до четырех планшетов на репликацию). Выращивать в течение 4 дней при температуре 21 °C. Отбеливайте взрослых особей, чтобы изолировать эмбрионы (см. шаг 2.3). Для каждого штамма поместите примерно 3500 эмбрионов на 14 планшетов (по 250 на планшет) и выращивайте в течение 3 дней при температуре 21 °C до стадии молодого взрослого человека. Промывают животных в пробирки объемом 1,5 мл с фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 0,01% (v/v) TX-100 (PBS/TX). Центрифуга при 1 000 x g в течение 2 мин. Аспирируйте и объединяйте животных из одного штамма в одну пробирку и промойте еще три раза не менее 1 мл PBS/TX. Отсасывайте до 1000 мкл, инвертируйте для смешивания и подсчитайте количество животных в 3 мкл три раза (см. шаг 2.3.9). Рассчитайте концентрацию животных и перенесите объем, соответствующий 3 000 животных, в новую пробирку для сшивания формальдегида. Убедитесь, что общий объем не менее чем в 10 раз превышает объем червячных гранул. 5. Сшивание формальдегида ВНИМАНИЕ: Работайте с формальдегидом в вытяжном шкафу, чтобы предотвратить воздействие пара. Добавьте формальдегид (конечная концентрация 1,8%) в пробирку с червями. Вращайте при комнатной температуре в течение 6 минут. Сразу замораживаем в жидком азоте. На этом этапе эксперимент можно приостановить, а образцы хранить при температуре -80 °C. Сшитый образец разморозить на водяной бане комнатной температуры в течение 3 мин и вращать в течение 16 мин при комнатной температуре. Добавьте 1,25 М глицина до конечной концентрации 125 мМ и вращайте в течение 5 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: До магнитного элюирования шариков держите образцы на льду или при температуре 4 °C и используйте ледяные буферы. Центрифугируют образец при 1 000 x g в течение 3 мин. Каждый раз промывайте водой по 1 мл PBS/TX. Дважды промыть 1 мл буфера ресуспензии (150 мМ NaCl, 50 мМ Hepes-Koh [рН 7,5], 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА], 0,01% TX-100, ингибитор протеазы [одна таблетка на 5 мл]). После последней промывки оставьте достаточно буфера, чтобы общий объем был как минимум в три раза больше объема гранул и минимум ~ 100 мкл. 6. Ультразвуковая обработка ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры ультразвуковой обработки зависят от типа и модели ультразвукового аппарата и животного этапа. Такие параметры, как объем и концентрация образца, интервалы включения/выключения, количество циклов и настройка мощности, должны быть оптимизированы опытным путем. Например, в течение определенного времени ультразвука можно контролировать лизис червей с помощью анализа белка и определять, когда концентрация достигает плато. Кроме того, контролируйте, когда средний размер сдвига геномной ДНК составляет примерно 200-1000.н., путем электрофореза ДНК, очищенной после реверсирования сшивания, на 1,5% геле агарозы/трис-ацетата-ЭДТА (ТАЕ). Измерьте объем образцов из предыдущего шага. Смешать и аликвотировать 90-120 мкл в полистирольную ультразвуковую трубку. Добавьте равный объем буфера для ресуспендирования, содержащего 2 моющих средства (150 мМ NaCl, 50 мМ Hepes-KOH [рН 7,5], 1 мМ ЭДТА, 0,2% дезоксихолата натрия, 0,7% саркозила). Ультразвуковая обработка в водяной бане при мощности 50% в течение 7 мин (20 с вкл./40 с выкл.) при 4 °C. Аккуратно перемешайте пипеткой. Повторяйте ультразвуковую обработку еще 7 минут. Перелейте ультразвуковой лизат в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 0,5 объемов буфера для ресуспензии без детергентов (150 мМ NaCl, 50 мМ Hepes-Koh [рН 7,5], 1 мМ ЭДТА) (например, добавьте 100 мкл буфера на 200 мкл образца). Центрифуга при 13 000 x g в течение 15 мин при 4 °C. Оставьте лизат в надосадочной жидкости и переложите в новую пробирку. При необходимости можно провести анализ белка для определения концентраций каждого лизата. Этот шаг может быть полезен для больших количеств образцов или межпробных сравнений. Тем не менее, стандартизация количества животных, как описано выше, хорошо работает для описанных здесь количеств образцов, поскольку существует лучшая корреляция с выходом хроматина/ДНК, определенным с помощью кПЦР. 7. Иммунопреципитация ПРИМЕЧАНИЕ: Масштабируйте количество антител и магнитных шариков в соответствии с объемом и концентрацией лизата. Разделите лизатную надосадочную жидкость на четыре части: три равных объема для каждого IP и 10% от объема одного IP в качестве входного (например, 100 мкл IP #1, 100 мкл IP #2, 100 мкл IP #3, 10 мкл входа). Перенесите лизат IP в ПЦР-пробирку объемом 200 мкл и храните входной лизат при -20 °C в пробирке объемом 1,5 мл. Добавьте 0,5 мкг антител к H3K9me3, антигистоновых антител H3 или IgG к соответствующему образцу IP. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи с ротацией. На следующий день аликвоту 9 мкл магнитных шариков с белковым покрытием G на одну пробирку объемом 1,5 мл. Дважды промыть шарики 1 мл FA-150 (150 мМ NaCl, 50 мМ Hepes-Koh [рН 7,5], 1 мМ ЭДТА, 1% ТХ-100, 0,1% дезоксихолат натрия). Ресуспендируйте магнитные шарики в буфере FA-150 до исходного объема, взятого из заготовки на шаге 7.3 выше. Добавьте 7,5 мкл к каждому IP. Инкубируют при 4 °C в течение 2 ч с ротацией. 8. Промывки и элюирование ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы магнитные шарики не высохли, быстро добавляйте каждый буфер для промывки или элюирования после аспирации предыдущей стирки. Используйте 0,2-1 мл следующих буферных растворов каждый раз, чтобы промыть бусины. Соберите шарики на магнитной подставке, чтобы аспирировать смывки. Выдерживайте каждую стирку при температуре 4 °C в течение 5 минут с вращением. Следуйте приведенному ниже порядку.Вымойте два раза FA-150. Промыть один раз FA-1M (FA-150 с 1 М NaCl). Промыть один раз FA-0,5M (FA-150 с 0,5 M NaCl). Пересадите в новую ПЦР-пробирку. Промыть один раз TE-LiCl (250 мМ LiCl, 10 мМ Tris-Cl [pH 8,0], 1 мМ ЭДТА, 1% IGEPAL CA-630, 1% дезоксихолат натрия). Дважды промыть TE+ (50 мМ NaCl, 10 мМ Tris-Cl [pH 8,0], 1 мМ ЭДТА, 0,005% IGEPAL CA-630).ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте обработку образца при комнатной температуре, если не указано иное. Аспирируйте последний буфер для промывки. Ресуспендировать магнитные шарики с 50 мкл элюирующего буфера ChIP (200 мМ NaCl, 10 мМ Tris-Cl [pH 8,0], 1 мМ ЭДТА, 1% додецилсульфат натрия [SDS]) и перенести в пробирку объемом 1,5 мл. Элюют при 65 °C в течение 15 мин в термомиксере со смешиванием при 1 000 об/мин в течение 5 с каждую минуту. Соберите бусины на магнитной подставке и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку. Повторите элюирование с еще 50 мкл элюирующего буфера ChIP. Объедините надосадочную жидкость в общей сложности на 100 мкл. Приступайте к обратному сшиванию и элюированию ДНК, как описано ниже. 9. Обратное сшивание и элюирование ДНК Разморозьте входной образец лизата. Долейте до 100 мкл элюирующим буфером ChIP. Добавьте 16,5 мкг РНКазы А к каждому IP-образцу и входному образцу. Инкубируют при температуре 37 °C в течение 1 ч. Добавьте 40 мкг протеиназы К и инкубируйте при 55 °C в течение 2 ч. Затем инкубируйте при температуре 65 °C в течение ночи. Охладите образцы до комнатной температуры и очистите ДНК с помощью набора для спин-колонки. 10. Настройка и запуск реакции кПЦР ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры праймера, настройки реакции и амплификатора должны быть изменены в соответствии с рекомендациями производителя для используемой реакционной смеси для количественной ПЦР. Подготовьте наборы праймеров, нацеленные на репортерную РНК-интерференцию GFP и контрольные области H3K9me3 с положительным и отрицательным обогащением. Температура плавления грунтовки составляет 60 °C. Последовательность праймеров приведена в Таблице материалов . Для входной ДНК сделайте четыре четырехкратных последовательных разведения (например, 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК IP может быть использована непосредственно или разбавлена (например, 1:2 или 1:3), чтобы обеспечить большее количество реакций. Пригодность разведения должна быть определена опытным путем, так как это может повлиять на производительность кПЦР. Организуйте все реакции, соответствующие одному набору праймеров, на одной ПЦР-планшете. Настройте технические дублирующие реакции для каждого входного разведения ДНК и каждого образца ДНК IP. Каждая реакция объемом 10 мкл содержит 1,5 мкл входной или IP-ДНК (или элюирующий буфер в качестве контроля), мастер-смесь для кПЦР (1x конечная концентрация), прямой праймер и обратный праймер (конечная концентрация 400 нМ для каждого праймера). На амплификаторе реального времени выполните следующую программу: начальная денатурация: 95 °C в течение 4 мин; амплификация и флуоресцентное детектирование: 40 циклов при 95 °C в течение 10 с и 60 °C в течение 30 с при считывании пластины; окончательное растяжение: 60 °C в течение 5 мин; кривая плавления: от 60 °C до 90 °C с шагом 0,5 °C, 5 с на шаг. 11. Определение эффективности усиления и проверка специфичности продукта Для каждого набора входных разведений ДНК постройте график четырех точек данных с [log10(1/dilution)] на оси x и [Input Cq] на оси y. Определите наклон линии наилучшего соответствия. Рассчитайте эффективность усиления. Идеальные наборы праймеров должны стабильно демонстрировать эффективность 95%-100%. Убедитесь, что все реакции имеют один резкий пик кривой плавления и что реакции с одним и тем же набором праймеров имеют одинаковую температуру плавления. Множественные пики или разные температуры плавления могут указывать на неспецифическое усиление. При необходимости можно провести реакции на стандартном 2% геле агарозы/ТАЭ при комнатной температуре, чтобы проверить размер полосы продукта. 12. Расчет процента ввода Рассчитайте Коэффициент разбавления на входе. Поскольку 10% объема IP-лизата было сохранено в качестве входа, коэффициент разбавления для разведения входной ДНК в соотношении 1:5 составляет 50. Определите коэффициент разбавления IP. Если ДНК ИС не разбавляют перед кПЦР, то коэффициент разбавления равен 1. Вычислите разницу Cq между IP и входом с поправкой на коэффициенты разбавления. Рассчитайте процент входных данных.