ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

הערה: ציר זמן של בדיקה מוצג באיור 1. 1. הכנת לוחות RNAi nematode growth medium (RNAi-NGM) הוציאו החוצה את E. coli HT115(DE3) המכיל GFP או וקטורי RNAi בקרה ממלאי גליצרול על לוחות אגר Luria-Bertani (LB) בתוספת 100 מיקרוגרם / מ”ל אמפיצילין. לדגור על החיידקים לילה ב 37 ° C. למחרת, הכינו צלחות RNAi-NGM (אגר 1.7% [w/v], 0.3% [w/v] NaCl, 0.25% [w/v] פפטון, 1 mM CaCl2, 5 מיקרוגרם / מ”ל כולסטרול, 25 mM אשלגן פוספט חיץ [pH 6.0], 1 mM MgSO4, 25 מיקרוגרם / מ”ל קרבניצלין, ו 5 mM איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside [IPTG]) על פי פרוטוקול סטנדרטי18.עבור כל זן בניסוי, הכינו לפחות שש לוחיות RNAi-NGM שנזרעו עם GFP RNAi (שתי לוחיות לכל אחד משלושת העותקים הביולוגיים) ושתי לוחיות RNAi-NGM שנזרעו עם RNAi בקרה (שכפול ביולוגי אחד). אוהל רופף את הצלחות עם נייר כסף כדי להגן מפני אור ולהשאיר לילה בטמפרטורת החדר לייבוש. באותו יום כמו צלחת RNAi-NGM לשפוך, להכין 4 מ”ל של תרביות נוזליות של חיידקי RNAi.בתנאים סטריליים, aliquot 4 מ”ל של מרק LB בתוספת 10 מיקרוגרם / מ”ל טטרציקלין ו 100 מיקרוגרם / מ”ל אמפיצילין לתוך צינורות תרבית. בחרו מושבות בודדות מצלחות האגר LB לכל צינור ודגרו במשך הלילה תוך כדי ניעור במשך כ-16 שעות בטמפרטורה של 37°C. זרעו חיידקי RNAi על לוחות RNAi-NGM.לאחר גדילת לילה, מדדו את הצפיפות האופטית (OD600) של תרביות באמצעות דילול של 1:5 חיידקים עם ציר LB. לדלל את חיידקי ה-RNAi ל-ODיחסית של 600 מתוך 2 באמצעות ציר LB בתוספת טטרציקלין של 10 מיקרוגרם/מ”ל ו-100 מיקרוגרם/מ”ל אמפיצילין. בתנאים סטריליים, יש להוסיף 150 μL של חיידקי ה-RNAi של הבקרה או ה-GFP לכל צלחת RNAi-NGM. אוהל את הצלחות עם נייר כסף ולאפשר לחיידקים לגדול לפחות 24 שעות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.הערה: ניתן לאחסן לוחות RNAi-NGM שאינם בשימוש הפוכים למשך עד שבוע אחד ב-4°C במיכל אטום בחושך. 2. התחלת בדיקת תורשה RNAi: הלבנה וציפוי עוברים לדור P0 הערה: לפני תחילת בדיקת הירושה RNAi, תולעים המכילות את כתב GFP mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3’UTR]7 צריכות להישמר ללא רעב ב 21 ° C במשך שני דורות לפחות. 4 ימים (96 שעות) לפני תחילת בדיקת התורשה של RNAi (איור 1), בחרו שלושה או ארבעה בוגרים גרבידים על כל צלחת NGM סטנדרטית בקוטר 35 מ”מ עם זרעי חיידקי OP50-1.הערה: שלוש צלחות NGM לכל זן מספיקות. עבור זנים עם פוריות נפגעת, ייתכן שיהיה צורך ביותר מארבעה בעלי חיים בכל צלחת. לאחר 4 ימים, ודא כי האוכלוסייה הבוגרת החלה להטיל עוברים על הצלחת. שטפו את התולעים מהלוחות לתוך צינורות של 1.5 מ”ל באמצעות 800 μL של חיץ M9 בתוספת Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, 1mMMgSO 4, 0.01% (v/v) TX-100). יש לחזור על השטיפה והבריכה לאותו צינור. בודדו את העוברים מהאוכלוסייה על ידי הלבנה באופן הבא.הכינו תמיסת הלבנה עם אקונומיקה (6% נתרן היפוכלוריט) ו-10 N NaOH ביחס נפח של 1.5:1. הכינו כמות מספקת כך שניתן יהיה להשתמש ב-250 מיקרוליטר לכל דגימה. צנטריפוגה את צינורות 1.5 מ”ל עם התולעים ב 1,000 x גרם במשך 1.5-2 דקות. שאפו את הסופרנטנט, והשאירו 100 מיקרוליטר מבלי להפריע ל’כדור’ התולעת. לחלופין, ניתן להשאיר את הצינורות למשך כ-2 דקות כדי לאפשר לתולעים לשקוע לפני השאיפה. הוסף 650 μL של ddH2O לכל צינור כדי להשיג נפח סופי של 750 μL.הערה: השלבים הבאים הם תלויי זמן. הוסיפו 250 μL של תמיסת ההלבנה לכל צינור והפעילו טיימר. כל 1-2 דקות, מערבלים היטב את הצינורות. לאחר 5 דקות, לבדוק את התולעים מתחת סטריאוסקופ כדי לפקח על השפלה של מבוגרים. ממשיכים לערבל עד שהתולעים מומסות לחלוטין ונשארים רק עוברים. צנטריפוגו מיד את הצינורות במהירות של 1,000 x גרם למשך דקה וחצי.הערה: ההלבנה בדרך כלל מושלמת תוך 6-7 דקות, אך יש לעקוב אחריה תחת סטריאוסקופ בהגדלה מספקת כדי לצפות בעוברים המשוחררים (פי 40). אל תשאירו את התולעים באקונומיקה לתקופה ממושכת, מכיוון שהדבר יפגע בעוברים. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנאטנט והשאירו בערך 50-100 μL. הוסיפו 1 מ”ל של חיץ M9 עם TX-100 כדי לשטוף ולערבב על ידי מערבולת. צנטריפוגה שוב ב 1,000 x גרם במשך 1.5-2 דקות ולשטוף לפחות עוד פעמיים. שאפו את הסופרנאטנט מהשטיפה הסופית והשאירו כ-100 מיקרוליטר בצינור. מערבבים על ידי מערבולת. פיפטה 2 μL מכל צינור פעמיים על שקופית זכוכית מסומנת. ספרו את העוברים באמצעות מונה ספירה כדי להעריך את ריכוז העוברים למיקרוליטר.הערה: ניתן להשתמש כאן בשקופיות עם בארות חלביות מרובות כדי לספור העתקים של זנים מרובים. ניתן לשטוף שקופיות ספירה ולעשות בהן שימוש חוזר. כדי להתחיל גידול אוכלוסייה מסונכרן למחצה, ערבבו ופיפטה נפח המכיל 250 עוברים על כל צלחת RNAi-NGM. השתמש בשני לוחות עבור כל שכפול. הניחו לנוזל להיספג. עבור דור P0 שטופל ב-RNAi, יש לדגור בטמפרטורה של 21°C למשך 4 ימים (96 שעות) (מהעוברים ועד לבגרות). הזמנים עשויים להשתנות בהתאם לגנוטיפ. איור 1: סכמת בדיקת תורשה של RNAi. ציר זמן מוצע להכנת לוחות RNAi-NGM והגדרת בדיקת תורשה RNAi. בוגרים Gravid נקטפים ביום -4 על צלחות NGM שנזרעו עם OP50-1. לאחר 4 ימים, צאצאים בוגרים מולבנים והעוברים מצופים על לוחות RNAi-NGM. דור P0 נחשף ל-RNAi במשך 4 ימים בטמפרטורה של 21°C. ברגע שהתולעים מגיעות לבגרות, ההעתקים עוברים על ידי הלבנה ומקבלים ניקוד לביטוי GFP של קו הנבט בכל דור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 3. מעבר וניקוד בכל דור עבור ביטוי GFP של קו הנבט הערה: כדי להקל על הניקוד, השתמש בתקליט ויניל כדי ליצור רפידות אגרוז עם רכסים ליניאריים כדי ליישר את התולעים. שיטה זו אומצה על ידי ריברה גומז ושוורצשטיין19. מכינים 1% (w/v) אגרוז על ידי המסת אגרוז ב-ddH2O בבקבוק קטן על ידי חימום במיקרוגל. מוסיפים ערבוב ומכסים בנייר כסף. אם נמס מחדש, מחממים את האגרוז על פלטה בחום של 200 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב. לאחר המסה, להפחית את החום ל 80 ° C. שטפו את התולעים מלוחות ה-NGM באמצעות 800 מיקרוליטר של חיץ M9 עם TX-100 לתוך צינור של 1.5 מ”ל. לשטוף את הצלחות פעמיים כדי להסיר את כל המבוגרים gravid. בדוק את הצלחות מתחת לסטריאוסקופ כדי לוודא שבעלי החיים נאספו ביעילות. צנטריפוגו את הצינורות במהירות של 1,000 x גרם למשך 1.5-2 דקות או אפשרו לתולעים להסתפק במשך 2 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשאירו 100 מיקרוליטר מבלי להפריע ל’כדור’ התולעת. הכינו רפידות אגרוז להרכבת התולעים כדלקמן.מניחים טיפה של 1% מומס (w/v) agarose על תקליט ויניל (שתואר קודם19) באמצעות פיפטה פסטר זכוכית (עם קצה צר שבור). כוון שקופית זכוכית כך שהקווים ברשומה יהיו אופקיים או אנכיים והנח את השקופית במהירות על טיפת אגרוז. המתן כ- 30 שניות לפני הסרת שקופית הזכוכית מהרשומה.הערה: אם אתה מבקיע גנוטיפים מרובים, ייתכן שיהיה שימושי ליצור כרית אגרוז גדולה יותר בשקופית אחת ולחתוך אותה לשניים באמצעות להב. הרכיבו את התולעים על כריות האגרוז.תחת הסטריאוסקופ, להוסיף כ 5 μL של 5 mM levamisole כרית agarose. דילול הלבמיסול צריך להיעשות טרי בכל שבוע. מעבירים בעדינות את צינורות התולעים כדי לערבב ולהעביר 5-10 מיקרוליטר תולעים על כרית האגרוז. העריכו את מספר התולעים בעין בעת הוספתן, כך שיהיו כ-40 תולעים בכל שכפול. סדרו את התולעים בשורות באמצעות פיק ריסים לניקוד קל יותר. הוסיפו כיסוי זכוכית.הערה: מגלשות עם בעלי חיים המותקנים בדרך זו יכולות להימשך מספר שעות לפני שהן מתייבשות. בודדו את העוברים מבעלי החיים הנותרים באמצעות פרוטוקול הלבנה (ראו שלב 2.3) לפני הניקוד של השקפים. צלחת 250 עוברים על לוחות NGM 35 מ”מ שנזרעו עם OP50-120. לאחר שהנוזל נספג, הפכו את הצלחות והחזירו אותן לאינקובטור של 21 מעלות צלזיוס. השתמש בסטריאוסקופ תפרחת עם ערכת מסננים GFP. ספור ורשום את מספר התולעים החיוביות של GFP ו- GFP שליליות בשקופיות עבור כל שכפול באמצעות מונה ספירה.הערה: לתולעים חיוביות של GFP יהיה ביטוי גרעיני של GFP בנבט שלהן ובעוברים ברחם. עם זאת, הנבט של תולעים שליליות של GFP לא יפלוט, עם זאת, כאשר ה-GFP יתחיל לפעול מחדש בדורות מאוחרים יותר, הפלואורסצנטיות עשויה להיות עמומה. זה עשוי להיות מועיל להרכיב זני תולעים נוספים שאינם מהונדסים כדי להסביר כל autofluorescence שנצפה. מעבר האוכלוסייה על ידי הלבנה, כמתואר לעיל, בערך כל 4 ימים (96 שעות) ב 21 °C (75 °F). לחלופין, ניתן לבצע את המעבר על פי לוח זמנים לסירוגין של 3 ימים / 4 ימים לנוחותכם. צלחת תוספת ~ 50 עוברים עבור הדורות החולפים הקצרים יותר אם לסירוגין, שכן ייתכן שיש יבול נמוך יותר של עוברים לאחר 72 שעות.הערה: שמור על זמן מעבר עקבי של דור P0 לאחר 4 ימים לאחר ציפוי. 4. אוסף בעלי חיים עבור ChIP הערה: מספר בעלי החיים והעיתוי תלויים בזן, בשלב ההתפתחותי, באפיטופ ובמספר מטרות המשקעים החיסוניים (IP). בדוגמה שלהלן, אספו בעלי חיים עבור שלושה כתובות IP: H3K9me3, היסטון H3 והדברת IgG. פרוטוקול ChIP הותאם מ-Askjaer et al.21. לפני איסוף דגימות ChIP, הרחיבו את הדור הקודם של בדיקת התורשה של RNAi בשלוש לוחיות NGM נוספות (לארבע לוחיות לפחות לכל שכפול). לגדול במשך 4 ימים ב 21 °C (75 °F). הלבינו את הבוגרים הגרבידיים כדי לבודד את העוברים (ראו שלב 2.3). עבור כל זן, צלחת כ -3,500 עוברים על 14 צלחות (250 לכל צלחת) ולגדול במשך 3 ימים ב 21 ° C לשלב הבוגר הצעיר. שטפו את בעלי החיים לתוך צינורות של 1.5 מ”ל עם מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 0.01% (v/v) TX-100 (PBS/TX). צנטריפוגה ברזולוציה של 1,000 x גרם למשך 2 דקות. יש לשאוף ולאגד את בעלי החיים מזן אחד לתוך צינור אחד ולשטוף שלוש פעמים נוספות עם לפחות 1 מ”ל של PBS/TX. לשאוף ל-1,000 μL, להפוך כדי לערבב, ולספור את מספר בעלי החיים ב-3 μL שלוש פעמים (עיין בשלב 2.3.9). מחשבים את ריכוז בעלי החיים ומעבירים נפח המתאים ל-3,000 בעלי חיים לצינור חדש להצלבת פורמלדהיד. ודא שהנפח הכולל הוא לפחות פי 10 מנפח גלולת התולעת. 5. קרוסלינקינג פורמלדהיד אזהרה: יש לעבוד עם פורמלדהיד במכסה אדים כדי למנוע חשיפה לאדים. מוסיפים פורמלדהיד (ריכוז סופי של 1.8%) לצינור המכיל את התולעים. סובבו בטמפרטורת החדר במשך 6 דקות. מיד להקפיא בחנקן נוזלי. ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה וניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הפשירו את הדגימה הצולבת באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות וסובבו במשך 16 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף גליצין 1.25 M לריכוז סופי של 125 mM וסובב במשך 5 דקות.הערה: עד להדבקת חרוזים מגנטיים, יש לשמור את הדגימות על קרח או בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש במאגרים קרים כקרח. צנטריפוגה את הדגימה ב 1,000 x גרם במשך 3 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ”ל PBS/TX בכל פעם. יש לשטוף פעמיים עם 1 מ”ל של חיץ השעיה (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], 0.01% TX-100, מעכב פרוטאז [טבליה אחת לכל 5 מ”ל]). לאחר השטיפה האחרונה, השאירו מספיק חיץ כדי להבטיח שהנפח הכולל יהיה לפחות פי שלושה מנפח הכדוריות ומינימום של ~100 מיקרוליטר. 6. סוניקציה הערה: פרמטרי הסוניקציה תלויים בסוג ובדגם של הסוניקטור ובמת בעלי החיים. פרמטרים כגון נפח וריכוז הדגימה, מרווחי הפעלה/כיבוי, מספר מחזורים והגדרת צריכת חשמל צריכים להיות ממוטבים אמפירית. לדוגמה, במהלך זמן של סוניקציה, עקוב אחר ליזה תולעת באמצעות בדיקת חלבון וקבע מתי הריכוז מגיע לרמה. בנוסף, יש לעקוב מתי גודל הגזירה הממוצע של הדנ”א הגנומי הוא בערך 200-1,000 bp על ידי אלקטרופורזה של DNA, מטוהר לאחר היפוך crosslinking, על ג’ל agarose/tris-acetate-EDTA (TAE) 1.5%. מדוד את נפח הדגימות מהשלב הקודם. מערבבים ומוסיפים 90-120 μL לצינור סוניקציה מפוליסטירן. הוסף נפח שווה של חיץ מתלה המכיל 2x דטרגנטים (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA, 0.2% נתרן deoxycholate, 0.7% sarkosyl). סוניק באמבט מים בעוצמה של 50% למשך 7 דקות (20 שניות מופעלות / 40 שניות כבויות) ב- 4 ° C. מערבבים בעדינות על ידי פיפט. חזור על הסוניקציה במשך 7 דקות נוספות. מעבירים את הליזט הסוניק לצינור של 1.5 מ”ל. הוסף 0.5 נפחים של חיץ מתלה ללא דטרגנטים (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA) (למשל, הוסף 100 μL של חיץ ל 200 μL של דגימה). צנטריפוגה ב-13,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C. שומרים את הליזט סופרנאטנט ומעבירים לצינור חדש. לחלופין, בצע בדיקת חלבון כדי לקבוע את הריכוזים של כל ליזט. שלב זה עשוי להיות שימושי עבור כמויות מדגם גדולות או השוואות בין מבחנים. עם זאת, סטנדרטיזציה של מספר בעלי החיים כפי שתואר לעיל עובדת היטב עבור כמויות הדגימה המתוארות כאן, שכן יש מתאם טוב יותר עם התשואה של כרומטין/DNA כפי שנקבע על ידי qPCR. 7. משקעים חיסוניים הערה: שנה את כמות הנוגדנים והחרוזים המגנטיים לנפח ולריכוז של ליזט. חלק את סופרנאטנט הליזט לארבעה חלקים: שלושה נפחים שווים לכל IP ו-10% מנפח IP אחד כקלט (למשל, 100 μL של IP #1, 100 μL של IP #2, 100 μL של IP #3, 10 μL של קלט). העבר את ליזה IP לצינור PCR של 200 μL ואחסן את ליזה הקלט ב -20 °C בצינור של 1.5 מ”ל. הוסף 0.5 מיקרוגרם של נוגדן נגד H3K9me3, נוגדן H3 נגד היסטון או IgG לדגימת ה- IP המתאימה. יש לדגור ב-4°C (75 °F) למשך הלילה עם סיבוב. למחרת, aliquot 9 μL של חלבון G מצופה חרוזים מגנטיים לכל IP לצינור יחיד 1.5 מ”ל. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ”ל FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7.5], 1 mM EDTA, 1% TX-100, 0.1% נתרן deoxycholate). השהה מחדש את החרוזים המגנטיים במאגר FA-150 לנפח המקורי שנלקח מהמלאי בשלב 7.3 לעיל. הוסף 7.5 μL לכל כתובת IP. יש לדגור ב-4°C למשך שעתיים עם סיבוב. 8. שטיפות ו elution הערה: כדי להבטיח שהחרוזים המגנטיים לא יתייבשו, הוסיפו במהירות כל חיץ כביסה או חיץ אלוציה לאחר השאיפה של הכביסה הקודמת. השתמש 0.2-1 מ”ל של פתרונות החיץ הבאים בכל פעם כדי לשטוף את החרוזים. אספו את החרוזים על מעמד מגנטי כדי לשאוף את השטיפות. יש לדגור על כל כביסה בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות עם סיבוב. בצע את ההזמנה כמפורט להלן.יש לשטוף פעמיים עם FA-150. יש לשטוף פעם אחת עם FA-1M (FA-150 עם 1 M NaCl). יש לשטוף פעם אחת עם FA-0.5M (FA-150 עם 0.5 M NaCl). העברה לצינור PCR חדש. יש לשטוף פעם אחת עם TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% נתרן deoxycholate). שטוף פעמיים עם TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 0.005% IGEPAL CA-630).הערה: המשך עיבוד הדגימה בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. שאפו את חיץ הכביסה האחרון. השהה מחדש את החרוזים המגנטיים עם 50 μL של חיץ אלוציית ChIP (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 1% נתרן דודציל סולפט [SDS]) והעבר לצינור 1.5 מ”ל. יש לערבב ב-65°C למשך 15 דקות בתרמומיקסר עם ערבוב ב-1,000 סל”ד למשך 5 שניות בכל דקה. אוספים את החרוזים על מעמד מגנטי ומעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש. חזור על ה- elution עם עוד 50 μL של מאגר אלוציית ChIP. אגרו את הסופרנאטנטים בסכום כולל של 100 μL. המשיכו לקרוסלינקינג הפוך ופליטת DNA, כמפורט להלן. 9. הצלבה הפוכה ואלוציית DNA הפשיר את דגימת הקלט ליזט. למעלה עד 100 μL עם מאגר Elution ChIP. הוסף 16.5 מיקרוגרם של RNase A לכל דגימת IP וקלט. לדגור ב 37 ° C במשך 1 שעות. מוסיפים 40 מיקרוגרם של פרוטאינאז K ודגורים ב-55°C למשך שעתיים. לאחר מכן, לדגור ב 65 °C (65 °F) במשך הלילה. מצננים את הדגימות לטמפרטורת החדר ומטהרים את הדנ”א בעזרת ערכת עמוד ספין. 10. הגדרה והפעלה של תגובת qPCR הערה: יש לשנות את הפרמטרים פריימר, הגדרת תגובה ותרמוסייקלר כך שיתאימו להמלצות היצרן לתמהיל תגובת qPCR הנמצא בשימוש. הכינו ערכות פריימר המכוונות לכתב ה-RNAi של GFP ולאזורי בקרת העשרה חיובית ושלילית של H3K9me3. טמפרטורת ההתכה של הפריימר היא 60 מעלות צלזיוס. ראו טבלת חומרים לרצפי פריימר. עבור דנ”א הקלט, בצע ארבעה דילולים סדרתיים פי ארבעה (לדוגמה, 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).הערה: ניתן להשתמש בדנ”א IP ישירות או לדלל אותו (לדוגמה, 1:2 או 1:3) כדי לאפשר תגובות נוספות. התאמת הדילול חייבת להיקבע אמפירית, שכן ביצועי qPCR עשויים להיות מושפעים. ארגן את כל התגובות המתאימות לערכת פריימר אחת על צלחת PCR אחת. הגדר תגובות טכניות כפולות עבור כל דילול DNA קלט וכל דגימת DNA IP. כל תגובה של 10 μL מכילה 1.5 μL של קלט או IP DNA (או חיץ אלוציה כבקרה), תערובת מאסטר qPCR (ריכוז סופי של 1x), פריימר קדמי ופריימר הפוך (ריכוז סופי של 400 ננומטר עבור כל פריימר). על thermocycler בזמן אמת, להפעיל את התוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית: 95 °C למשך 4 דקות; הגברה וזיהוי פלואורסצנטי: 40 מחזורים של 95 ° C עבור 10 s ו 60 ° C עבור 30 s עם לוח לקרוא; הארכה סופית: 60°C למשך 5 דקות; עקומת התכה: מ-60°C עד 90°C במרווחים של 0.5°C, 5 שניות לכל צעד. 11. קביעת יעילות הגברה ואימות ספציפיות המוצר עבור כל קבוצה של דילולי DNA קלט, התווה את ארבע נקודות הנתונים עם [log10(1/dilution)] על ציר x ו- [Input Cq] על ציר y. לקבוע את השיפוע של הקו של ההתאמה הטובה ביותר. חשב את יעילות ההגברה. ערכות פריימר אידיאליות אמורות להציג באופן עקבי יעילות של 95%-100%. בדקו שלכל התגובות יש שיא עקומת התכה חד אחד ושלתגובות עם אותה ערכת פריימר יש אותה טמפרטורת התכה. פסגות מרובות או טמפרטורות התכה שונות עשויות להצביע על הגברה לא ספציפית. לחלופין, הפעל תגובות על ג’ל סטנדרטי של 2% agarose/TAE בטמפרטורת החדר כדי לוודא את גודל רצועת המוצר. 12. חישוב אחוז הקלט חשב את גורם דילול הקלט. מכיוון ש-10% מנפח ה-IP ליזט נשמר כקלט, מקדם הדילול עבור דילול 1:5 של DNA קלט הוא 50. קבע את גורם דילול ה- IP. אם ה- DNA IP אינו מדולל לפני qPCR, גורם הדילול הוא 1. חשב את הפרש ה- Cq בין ה- IP לקלט המותאם לגורמי דילול. חשב את אחוז הקלט.