Bu protokol, C. elegans’ta RNAi kaynaklı susturma ve ilişkili kromatin modifikasyonlarının epigenetik kalıtımını incelemek için bir RNA girişimini ve ChIP testini açıklar.
Nesiller arası epigenetik kalıtım (TEI), kodlamayan RNA’lar ve kromatin modifikasyonları gibi faktörler aracılığıyla genom dizisini değiştirmeden germ hattı boyunca bilgi aktarımına izin verir. Nematod Caenorhabditis elegans’ta RNA interferansı (RNAi) kalıtımı olgusu, bu model organizmanın kısa yaşam döngüsünden, kendi kendine yayılmasından ve şeffaflığından yararlanan TEI’yi araştırmak için etkili bir modeldir. RNAi kalıtımında, hayvanların RNAi’ye maruz kalması, ilk tetikleyicinin yokluğunda birden fazla nesil boyunca devam eden hedef lokusta gen susturulmasına ve değişmiş kromatin imzalarına yol açar. Bu protokol, germ hattı ile eksprese edilen bir nükleer yeşil floresan protein (GFP) raportörü kullanılarak C. elegans’ta RNAi kalıtımının analizini açıklar. Muhabir susturma, GFP’yi hedefleyen çift sarmallı RNA eksprese eden bakterilerin hayvanlarla beslenmesiyle başlatılır. Her nesilde, senkronize gelişimi sürdürmek için hayvanlar geçirilir ve raportör gen susturma mikroskopi ile belirlenir. Seçilmiş nesillerde, GFP raportör lokusunda histon modifikasyon zenginleşmesini ölçmek için kromatin immünopresipitasyon (ChIP)-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) için popülasyonlar toplanır ve işlenir. RNAi kalıtımını incelemek için bu protokol, küçük RNA ve kromatin yolaklarındaki TEI faktörlerini daha fazla araştırmak için kolayca değiştirilebilir ve diğer analizlerle birleştirilebilir.
Epigenetik kalıtım, gen düzenleyici bilgilerin nesiller boyunca aktarılmasına izin verir ve bu nedenle ebeveynlerin çevresinin veya deneyimlerinin soylarını etkilemesine izin verebilir. C. elegans’ta, eksojen çift sarmallı RNA (dsRNA) tarafından başlatılan germ hattı gen susturması, orijinal tetikleyiciyemaruz kalmayan döllerde birden fazla nesil için kalıtsal olabilir 1,2,3,4. RNA interferansı (RNAi) kalıtımı olarak adlandırılan bu süreç, C. elegans’ta piRNA tarafından başlatılan çok kuşaklı susturma2,5, paramutasyon/RNAe (RNA kaynaklı epigenetik susturma)6,7,8 ve çok kopyalı dizi tarafından başlatılan susturma9 dahil olmak üzere, küçük RNA ve kromatin düzenleme makineleri için örtüşen ancak farklı gereksinimleri olan birkaç ilgili epigenetik susturma fenomeninden biridir . C. elegans eksojen RNAi’de dsRNA, hedef mRNA’larını tanımak için birincil Argonaute proteinleri ile bir kompleks içinde hareket eden küçük enterferans yapan RNA’lara (siRNA’lar) işlenir. Bu hedefleme, hem sitoplazmik hem de nükleer susturma yolları yoluyla hedef mRNA’yı susturmak için ikincil Argonotlar ile ilişkili ikincil siRNA’ların amplifikasyonuna yol açar. Germ hattı eksprese edilen RNAi hedefleri için, nükleer ikincil Argonaute HRDE-1 ve ek nükleer RNAi faktörleri, yeni ortaya çıkan transkriptleri hedef alır, bu da transkripsiyonel baskılama ve H3K9me310 dahil olmak üzere baskılayıcı kromatin işaretlerini biriktirmek için histon metiltransferazların işe alınmasına neden olur. Histon H3K9me3, RNAi kalıtımı11,12 ile germ hattı ile eksprese edilen yeşil floresan protein (GFP) transgenlerinin kalıtsal susturulmasının kurulmasını destekler.
Bu protokolün amacı, RNAi kalıtımı için bir raportör olarak germ hattında bir GFP-histon füzyon proteinini eksprese eden bir transgen kullanmak ve kromatin immünopresipitasyon ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (ChIP-qPCR) kullanarak raportör transgen lokusunda histon modifikasyonlarındaki değişiklikleri test etmektir. Bu protokol, raportör susturmayı başlatmak için standartlaştırılmış bir plaka bazlı RNAi besleme yaklaşımını açıklar. Ayrıca, alkalin hipoklorit tedavisi (‘ağartma’) ile gravid yetişkinlerden utero embriyoları izole ederek hayvanların nesiller arasında geçirilmesi için ayrıntılı bir zaman çizelgesi sağlar. Floresan mikroskobu ile popülasyonun bir alt kümesinde GFP susturma sıklığının izlenmesi ve histon H3K9me3 ChIP-qPCR için yöntemler ve temsili veriler de açıklanmaktadır. Raportör tabanlı RNAi kalıtım deneyleri, epigenetik düzenlemede genetik ve çevresel faktörlerin rollerini işlevsel olarak incelemek için oldukça izlenebilir bir sistem sağlar 13,14 ve bu tür raportörleri kullanan genetik taramalar, hem 2,3,15 için gerekli olan genleri hem de16,17 nesiller arası epigenetik kalıtım süresini negatif olarak düzenleyen genleri tanımlamıştır.
Bu protokolde, dsRNA, C. elegans18’de standart bir yöntem haline gelen besleme yoluyla tanıtılır. RNAi kalıtım deneyleri için besleme yaklaşımı, büyük bir P0 popülasyonu 2,11,12,22,23,24,25 elde etmek için kolay bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, RNAi maruziyetinin zamanlaması ve süresi, transgen susturmanın etkinliğini etkiler26 ve RNAi bakterilerinin konsantrasyonu, kalıtsal RNAi susturmanınkalıcılığını etkiler 1. Bu nedenle, standartlaştırılmış RNAi bakterileri ve solucan büyümesi, tutarlı bir GFP susturma seviyesi ve kalıtım süresi elde etmek için önemlidir. Burada embriyolar RNAi plakaları üzerine kaplanır, böylece P0 hayvanları yumurtadan RNAi bakterilerine maruz kalır. Alternatif yaklaşımlar, senkronize L1 24,27 veyaL4 25 evre hayvanlarını RNAi-NGM plakalarına kaplamıştır. Ek olarak, açlık ve diğer stresler RNAi kalıtımının13 sürdürülmesini etkilediğinden, gıda arzının aşırı kalabalıklaşmasını ve tükenmesini önlemek için plakalar izlenmelidir. Beslenme yoluyla RNAi’yi başlatmaya bir alternatif olarak, öncü C. elegans RNAi kalıtım çalışmalarından bazıları, dsRNA konsantrasyonunun daha fazla kontrolünü sağlayangonad enjeksiyonu yoluyla RNAi’yi indükledi 1,28.
Bu protokolde, her nesil, daha önce tarif edildiği gibialkalin hipoklorit muamelesi ile bir popülasyon olarak kabul edilir 16,22,23,24. Hipoklorit arıtımı, F1 neslinin ebeveyn ortamından22 RNAi bakterileri ile kontamine olmamasını sağlar ve olası istenmeyen popülasyon darboğazını önler. Bununla birlikte, toplu geçiş de bir sınırlama olabilir, çünkü bireysel hayvanlar farklı kalıtım modellerinesahip olabilir 1,29. Her nesli oluşturmak için alternatif bir yöntem, tek tek hayvanlarıseçmektir 1,2,9,11,25. Bu yaklaşım, soylar içindeki fenotiplerin izlenmesine ve genetik çaprazlamaların dahil edilmesine izin verir. Soy analizi, düşük penetranslı fenotipler için de avantajlı olabilir12.
Floresan protein ekspresyonu, RNAi kaynaklı susturma 2,3,4,12,14,15,16,25,30’un güçlü ve kullanışlı bir okumasıdır. Bu protokolde açıklandığı gibi, GFP ifadesi manuel olarak AÇIK veya KAPALI 11,12,15,16,25 olarak puanlanabilir. Manuel puanlama,nitel yoğunluk seviyeleri 3,4,14 atanarak daha da iyileştirilebilir. Alternatif olarak, mikroskopi görüntülerinin 11,12,14,25,27 otomatik yoğunluk puanlaması veya canlı hayvanların akış sitometrisi floresan ölçümü2 kantitatif ve yüksek verimli bir okuma sağlayabilir. Bununla birlikte, raportör ifadesi germ hattı ile sınırlı olduğundan, otomatik yaklaşımların bir uyarısı, özellikle çalışma anormal germ hattı gelişimine sahip mutantları içeriyorsa, susturulmuş GFP ekspresyonu olan hayvanlar ile germ hattı olmayan hayvanlar arasında ayrım yapmaları gerektiğidir. GFP floresansına alternatif olarak, RNAi hedef pre-mRNA ve mRNA seviyeleri 2,16,23,24’ü ölçmek için ters transkripsiyon (RT)-qPCR kullanılabilir. Bu yaklaşım, RNA’yı hedef alan susturmanın daha doğrudan bir okumasını sağlar ve özellikle susturmanın görünür bir fenotip üretmediği diğer RNAi hedefleri için yararlıdır. Yapay GFP raportörlerinin kullanılmasının bir sınırlaması, eksojen ve endojen dizilerin nesiller arası RNAi11’de diferansiyel olarak düzenlenmesidir. Bu nedenle, sıcaklığa duyarlı embriyonik öldürücü alel oma-1(zu405)1,11,16,25 gibi endojen hedeflerle yapılan çalışmalar, floresan transgen raportörlerine tamamlayıcı bir yaklaşım olarak düşünülmelidir.
ChIP’nin RNAi kalıtım testleri bağlamında analizi, tedaviler ve replikasyonlar arasında karşılaştırma yapılmasını gerektirir. İlk olarak, numuneler arasındaki başlangıç malzemesindeki farklılıkları hesaba katmak için, ChIP sinyali, ‘Giriş yüzdesi’ ile aynı lokusta Giriş sinyaline normalleştirilir. Bir histon H3 ChIP’nin paralel olarak işlenmesi, herhangi bir histon modifikasyon değişikliğinin nükleozom yoğunluğundaki değişikliklere karşılık gelip gelmediğini belirlemeye yardımcı olacaktır. Ek olarak, ChIP çok adımlı bir süreç olduğundan, verimlilik numuneler arasında değişebilir. Uygun pozitif ve negatif kontrol lokuslarının seçimi, numuneler ve deneyler arasındaki sinyal-gürültü oranını değerlendirmek ve karşılaştırmak için yararlıdır. Ek olarak, numuneler arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırmak için, RNAi hedefindeki ChIP DNA qPCR eşik döngüsü değerleri genelliklebir kontrol odağı 3,11,15,23,30,31’e normalleştirilir. RNAi tedavisinin etkilerini değerlendirmek için, tedavi RNAi’sindeki ChIP sinyalinin kontrol veya RNAi olmayan koşullara oranı da karşılaştırılır. Mevcut yaklaşımın bir sınırlaması, ChIP’nin bütün hayvanlarla gerçekleştirilmesidir, RNAi tedavisine verilen yanıt ise germ hattına özgü olabilir. Bu uyarının üstesinden gelmek için bir yaklaşım, izole germ hattı çekirdeklerini kullanarak ChIP gerçekleştirmektir. ChIP’yi optimize etmek için ek teknik hususlar da başka bir yerde kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır32,33.
Genel olarak, bu RNAi kalıtımı ve ChIP protokolü, nesiller arası epigenetik düzenlemeyi daha fazla keşfetmek için diğer tekniklerle entegre edilebilecek ayrıntılı ve uyarlanması kolay bir temel sağlar. Örneğin, kromatin manzarasının hem RNAi hedefine yakın hem de genom çapında bir ölçekte daha ayrıntılı bir görünümü için ChIP DNA’dan (ChIP-seq) yüksek verimli dizileme kütüphaneleri oluşturulabilir.
The authors have nothing to disclose.
Araçları geliştiren ve paylaşan ve bu makalede çalışmalarına atıfta bulunulan C. elegans topluluğundaki laboratuvarlara teşekkür etmek istiyoruz. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) Projesi tarafından A.L.S.’ye (PJT-175245) hibe ile desteklenmiştir. CL, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) lisansüstü bursu (PGS-D) tarafından desteklenmektedir.
Agarose | Bioshop | AGA002 | |
Ampicillin | Bioshop | AMP201 | Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab8898 | Concentration is batch-dependent (0.9 – 1 mg/mL). |
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab1791 | Concentration is batch-dependent (0.7 – 1 mg/mL). |
Bleach (6% Sodium hypochlorite) | Lavo | 02358107 | |
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter | NA | SX1263 | Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge. |
Carbenicillin | BioShop | CAR544 | Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Dynabeads Protein G Magnetic Beads | Invitrogen | 10003D | |
E. coli strain HT115(DE3) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | HT115(DE3) | |
E. coli strain OP50-1 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-1 | |
EDTA (0.5 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15575020 | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Formaldehyde (37%) | Sigma | F8775 | |
Glycine | Sigma | 50046 | Make a 1.25 M solution and store at 4 °C. |
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) | Teknova | H1035 | |
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells | VWR | 100488-904 | |
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) | BioShop | NON999 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) | BioShop | IPT001 | Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | |
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin | NA | NA | Standard lab recipe. |
Levamisole (Tetramisole hydrochloride) | Sigma | L9756 | Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C. |
LiCl (8 M) | Sigma | L7026 | |
M9 Buffer | NA | NA | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4. |
Magnetic Separator (1.5 mL tubes) | Applied Biosystems | A13346 | |
Magnetic Separator (0.2 mL tubes) | Permagen | MSR812 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12541B | |
Microscope Slide | Technologist Choice | LAB-037 | |
NaCl (5 M) | Promega | V4221 | For ChIP buffers. |
NaOH | Sigma | S5881 | Make a 10 M solution and store at room temperature. |
NGM Plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin. |
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) | Cell Signaling Technology | 2729 | |
Petri Dishes (35 mm x 10 mm) | Sarstedt | 82.1135.500 | |
Phosphate Buffered Saline (10X) | Fisher BioReagents | BP3991 | |
Plasmid – Control RNAi | Addgene | L4440 (Plasmid #1654) | |
Plasmid – GFP-targetting RNAi | Addgene | L4417 (Plasmid #1649) | Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used. |
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG |
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT |
Primer pair [clec-18] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA |
Primer pair [gfp exon 1] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC |
Primer pair [gfp exon 4] | Integrated DNA Technologies | NA | F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA |
Primer pair [hrp-2] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA |
Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 11836170001 | |
Proteinase K | Bioline | BIO-37084 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 | |
RNAi-NGM plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG. |
RNase A | Sigma | R4642 | |
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma | L5777 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
SDS | Sigma | 74255 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature. |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
Sonication Tube | Evergreen | 214-3721-010 | |
Sonication Tube Cap | Evergreen | 300-2911-020 | |
Sonicator | Qsonica | Q800R3-110 | |
Streptomycin sulfate | Bioshop | STP101 | Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
TAE buffer (1X) | NA | NA | 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA |
Tally counter clicker | Uline | H-7350 | |
Tetracycline | Bioshop | TET701 | Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C. |
Thermomixer | Eppendorf | 05-400-205 | |
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |