線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

注:アッセイのタイムラインを 図 1 に示します。 1. RNAi線虫増殖培地(RNAi-NGM)プレートの調製 100 μg/mL アンピシリンを添加した Luria-Bertani (LB) 寒天プレート上に、グリセロールストックの GFP またはコントロール RNAi ベクターを含む大 腸菌 HT115(DE3) をストリークアウトします。バクテリアを37°Cで一晩インキュベートします。 翌日、標準プロトコル18 に従って、RNAi-NGM プレート(1.7% [w/v] 寒天培地、0.3% [w/v] NaCl、0.25% [w/v] ペプトン、1 mM CaCl2、5 μg/mL コレステロール、25 mM リン酸カリウムバッファー [pH 6.0]、1 mM MgSO4、25 μg/mL カルベニシリン、5 mM イソプロピル β-d-1-チオガラクトピラノシド [IPTG]) を調製します。アッセイの菌株ごとに、GFP RNAiを播種したRNAi-NGMプレートを最低6枚(3つの生物学的複製ごとに2枚のプレート)と、コントロールRNAiを播種したRNAi-NGMプレート2枚(生物学的複製1枚)を調製します。 光から保護するためにプレートをホイルでゆるくテント張りにし、室温で一晩放置して乾燥させます。 RNAi-NGMプレートを流し込むのと同じ日に、RNAi細菌の液体培養液4 mLを調製します。無菌条件下で、10 μg/mL のテトラサイクリンと 100 μg/mL のアンピシリンを添加した LB ブロス 4 mL を培養チューブに分注します。LB寒天プレートから各チューブに単一のコロニーをピックし、37°Cで約16時間振とうしながら一晩インキュベートします。 RNAi-NGMプレートにRNAi細菌を播種します。一晩増殖させた後、LBブロスで1:5に希釈したバクテリアを使用して培養物の光学濃度(OD600)を測定します。 10 μg/mL のテトラサイクリンと 100 μg/mL のアンピシリンを添加した LB ブロスを使用して、RNAi 細菌を相対 OD600 の 2 に希釈します。 無菌条件下で、150 μLのコントロールまたはGFP RNAi細菌を各RNAi-NGMプレートに加えます。 プレートをホイルでテント張りし、使用前に室温で少なくとも24時間バクテリアを増殖させます。注:未使用のRNAi-NGMプレートは、4°Cで最長1週間、密閉容器に入れて暗所で保存できます。 2. RNAi遺伝アッセイの開始:P0世代の胚の漂白とプレーティング 注:RNAi Inheritance アッセイを開始する前に、GFP レポーター mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3’UTR]7 を含む線虫を 21 °C で飢餓状態に維持し、少なくとも 2 世代維持する必要があります。 RNAi遺伝アッセイ開始の4日前(96時間)に(図1)、OP50-1細菌を播種した35 mm標準NGMプレートに3〜4匹の成人をピックします。注:菌株ごとに3枚のNGMプレートで十分です。生殖能力が損なわれている株の場合、プレートあたり4頭以上の動物が必要になる場合があります。 4日後、成体集団がプレートに胚を産み始めたことを確認します。Triton X-100(TX-100)(22 mM KH 2 PO 4、42 mM Na2HPO 4、86 mM NaCl、1 mM MgSO 4、0.01% (v/v) TX-100)を添加した 800 μL の M9 バッファーを使用して、プレートから線虫を 1.5 mL チューブに洗い流します。洗浄を繰り返し、同じチューブにプールします。 次のように漂白することにより、胚を集団から分離します。漂白剤(6%次亜塩素酸ナトリウム)と10 N NaOHを1.5:1の体積比で漂白溶液を調製します。各サンプルに250μLが使用できる十分な量を用意します。 1.5 mLチューブをワームで1,000 x g で1.5〜2分間遠心分離します。 上清を吸引し、線虫の「ペレット」を乱さずに100μLを残します。あるいは、チューブを約2分間放置して、ワームが沈降してから吸引することもできます。 各チューブに650μLのddH2Oを加えて、最終容量750μLにします。注: 次の手順は時間的制約があります。 各チューブに250μLの漂白液を加え、タイマーを開始します。 1〜2分ごとに、チューブを完全にボルテックスします。5分後、ステレオスコープの下のワームをチェックして、成虫の劣化を監視します。 ワームが完全に溶解し、胚だけが残るまでボルテックスを続けます。直ちにチューブを1,000 x g で1.5分間遠心分離します。注:漂白は通常6〜7分以内に完了しますが、放出された胚を観察するのに十分な倍率(40倍)でステレオスコープで監視する必要があります。胚を危険にさらすため、ワームを漂白剤に長時間放置しないでください。 遠心分離後、上清を吸引し、約50〜100μLを残します。 TX-100でM9緩衝液1mLを加え、ボルテックスで洗浄・混合する。1,000 x g で1.5〜2分間再度遠心分離し、さらに少なくとも2回洗浄します。 最終洗浄から上清を吸引し、約100μLをチューブ内に残します。ボルテックスで混ぜます。各チューブから2 μLを標識スライドガラスに2回ピペットで移します。集計カウンターを使用して胚を数え、マイクロリットルあたりの胚の濃度を推定します。注:複数のフロストウェルを含むスライドは、ここで複数の菌株の複製をカウントするために使用できます。計数スライドは洗浄して再利用できます。 半同期した個体数増加を開始するには、250個の胚を含むボリュームを混合し、各RNAi-NGMプレートにピペットで移します。各反復に 2 枚のプレートを使用します。液体を吸収させます。 RNAiで処理したP0世代は、21°Cで4日間(96時間)インキュベートします(胚から成体まで)。タイミングは遺伝子型によって異なる場合があります。 図1:RNAi遺伝アッセイの概略図。RNAi-NGMプレート調製とRNAi継承アッセイのセットアップのタイムラインを提案しました。妊娠した成虫は、OP50-1で播種されたNGMプレートに-4日目に摘み取られます。4日後、成体の子孫を漂白し、胚をRNAi-NGMプレートに播種します。P0世代は、21°Cで4日間RNAiに曝露されます。 線虫が成虫になると、複製は漂白によって継代され、各世代の生殖細胞系GFP発現についてスコアリングされます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 3. 生殖細胞系GFP発現の各世代の継代とスコアリング 注:スコアリングを容易にするために、ビニールレコードを使用して、線状の隆起のあるアガロースパッドを作成し、ワームを並べます。この方法は、Rivera Gomez と Schvarzstein19 から採用されました。 電子レンジで加熱することにより、アガロースをddH2Oに溶解して1%(w / v)アガロースを小さなフラスコに調製します。攪拌子を加え、ホイルで覆います。再溶解する場合は、アガロースをホットプレート上で200°Cで攪拌しながら加熱します。溶けたら80°Cまで火を弱めます。 800 μL の M9 バッファーと TX-100 を 1.5 mL チューブに入れて、NGM プレートから線虫を洗い流します。プレートを2回洗って、妊娠した成虫をすべて取り除きます。ステレオスコープの下のプレートをチェックして、動物が効率的に収集されていることを確認します。 チューブを1,000 x g で1.5〜2分間遠心分離するか、ワームを2分間沈殿させます。上清を吸引し、ワームの「ペレット」を乱さずに100μLを残します。 ワームを取り付けるためのアガロースパッドを次のように準備します。ガラス製のパスツールピペット(狭い方の端を折った状態)を使用して、溶かした1%(w / v)アガロースをビニールレコード(前述19)に一滴垂らします。 レコード上の線が水平または垂直になるようにスライドガラスを向け、スライドをアガロースの滴にすばやく置きます。約30秒待ってから、スライドガラスをレコードから取り外します。注:複数の遺伝子型をスコアリングする場合は、1枚のスライドで大きなアガロースパッドを作成し、ブレードを使用して半分にカットすると便利な場合があります。 ワームをアガロースパッドに取り付けます。ステレオスコープの下で、約 5 μL の 5 mM レバミゾールをアガロースパッドに加えます。レバミゾールの希釈は毎週新鮮にする必要があります。. ワームのチューブを静かにはじいて混合し、5〜10 μLのワームをアガロースパッドに移します。反復ごとに約 40 匹の線虫が存在するように、線虫が追加されるときに目視で線虫の数を推定します。 採点しやすいように、まつげピックを使用してワームを列に並べます。ガラスのカバーガラスを追加します。注意: この方法で動物が取り付けられたスライドは、乾燥するまで数時間続くことがあります。 スライドにスコアを付ける前に、漂白プロトコル(ステップ2.3を参照)を使用して残りの動物から胚を分離します。OP50-120を播種した35 mm NGMプレートに250個の胚を播種します。液体が吸収されたら、プレートをひっくり返して21°Cのインキュベーターに戻します。 GFPフィルターセットを備えた蛍光ステレオスコープを使用します。集計カウンターを使用して、各繰り返しのスライド上のGFP陽性線虫とGFP陰性線虫の数をカウントし、記録します。注:GFP陽性線虫は、生殖細胞系および 子宮内の胚に核GFP発現を有する。GFP陰性線虫の生殖細胞系は蛍光を発しませんが、後の世代でGFPが再びオンになり始めると、蛍光が暗くなる可能性があります。観察された自家蛍光を説明するために、追加の非トランスジェニック線虫株をマウントすることが役立つ場合があります。 上記のように、21°Cで約4日(96時間)ごとに漂白することにより、集団を継代する。 あるいは、便宜上、3日/4日のスケジュールを交互に行うこともできます。72時間後に胚の収量が低くなる可能性があるため、交互に行う場合は、継代代が短い世代のために余分な~50個の胚をプレートします。注:P0世代の継代時間は、胚の播種後4日間で一定に保ちます。 4. ChIPの動物回収 注:動物の数とタイミングは、菌株、発生段階、エピトープ、および免疫沈降(IP)ターゲットの数によって異なります。以下の例では、H3K9me3、ヒストンH3、IgGコントロールの3つのIPについて動物を収集します。ChIPプロトコルは、Askjaerら21から採用されました。 ChIPサンプルを採取する前に、前世代のRNAi継承アッセイを3枚のNGMプレート(1回あたり少なくとも4枚のプレート)で拡張します。21°Cで4日間増殖させます。 妊娠した成虫を漂白して胚を分離します(ステップ2.3を参照)。 各菌株について、約3,500個の胚を14枚のプレート(プレートあたり250個)に播種し、21°Cで3日間若年成体期まで増殖させます。 0.01%(v/v)TX-100(PBS/TX)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で動物を1.5 mLチューブに洗浄します。1,000 x g で 2 分間遠心分離します。動物を1つの菌株から1本のチューブに吸引してプールし、少なくとも1 mLのPBS/TXでさらに3回洗浄します。 1,000 μLに吸引し、反転させて混合し、3 μL中の動物数を3回カウントします(ステップ2.3.9参照)。 動物の濃度を計算し、3,000匹の動物に相当する容量をホルムアルデヒド架橋用の新しいチューブに移します。 総量がワームペレットの体積の少なくとも10倍であることを確認してください。 5. ホルムアルデヒド架橋 注意: 蒸気への曝露を防ぐために、ドラフト内でホルムアルデヒドを使用してください。 ホルムアルデヒド(最終濃度1.8%)をワームの入ったチューブに加えます。室温で6分間回転させます。 すぐに液体窒素で凍結します。このステップで実験を一時停止し、サンプルを-80°Cで保存することができます。 架橋したサンプルを室温のウォーターバスで3分間解凍し、室温で16分間回転させます。 最終濃度 125 mM になるように 1.25 M グリシンを添加し、5 分間回転させます。注:磁気ビーズが溶出するまでは、サンプルを氷上または 4 °C に保ち、氷冷バッファーを使用してください。 サンプルを 1,000 x g で 3 分間遠心分離します。毎回1 mLのPBS/TXで3回洗浄します。1 mL の再懸濁緩衝液(150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM エチレンジアミン四酢酸 [EDTA]、0.01% TX-100、プロテアーゼ阻害剤 [5 mL あたり 1 錠]) で 2 回洗浄します。 最後の洗浄後、総容量がペレット容量の少なくとも3倍、最小~100μLになるように、十分なバッファーを残します。 6.超音波処理 注:超音波処理パラメータは、超音波処理器と動物ステージの種類とモデルによって異なります。サンプルの量と濃度、オン/オフ間隔、サイクル数、出力設定などのパラメータは、経験的に最適化する必要があります。例えば、超音波処理の経時的経過にわたって、タンパク質アッセイを用いて線虫の溶解をモニターし、濃度がプラトーに達する時期を決定する。さらに、ゲノムDNAの平均せん断サイズが約200〜1,000 bpであるときに、1.5%アガロース/トリスアセテート-EDTA(TAE)ゲル上で、架橋反転後に精製されたDNAの電気泳動によって監視します。 前のステップでサンプルの量を測定します。90〜120μLをポリスチレン超音波処理チューブに混合して分注します。 界面活性剤2個(150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM EDTA、0.2%デオキシコール酸ナトリウム、0.7%サルコシル)を含む等量の再懸濁バッファーを加えます。 4°Cで50%の電力で7分間(20秒オン/40秒オフ)の水浴超音波処理装置で超音波処理します。 ピペッティングで静かに混合します。超音波処理をさらに7分間繰り返します。 超音波処理したライセートを1.5mLチューブに移します。界面活性剤を含まない0.5容量の再懸濁バッファー(150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM EDTA)を添加します(例:200 μLのサンプルに100 μLのバッファーを添加します)。 13,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 ライセート上清を保管し、新しいチューブに移します。 必要に応じて、タンパク質アッセイを実施して、各ライセートの濃度を決定します。このステップは、大量のサンプルやアッセイ間の比較に役立ちます。ただし、上記のように動物の数を標準化すると、qPCRによって決定されるクロマチン/DNAの収量との相関性が向上するため、ここで説明するサンプル量に対してはうまく機能します。 7. 免疫沈降 注:抗体と磁気ビーズの量は、ライセートの体積と濃度に合わせて調整してください。 ライセート上清を4つの部分に分けます:各IPに3つの等量、1つのIPの容量の10%をインプットとして(例:IP #1 100 μL、IP #2 100 μL、IP #3 100 μL、インプット10 μL)。IPライセートを200 μLのPCRチューブに移し、インプットライセートを1.5 mLチューブに-20°Cで保存します。 0.5 μgの抗H3K9me3抗体、抗ヒストンH3抗体、またはIgGを適切なIPサンプルに添加します。4°Cで一晩回転しながらインキュベートします。 翌日、1 つの 1.5 mL チューブに IP あたり 9 μL のプロテイン G コーティング磁気ビーズを分注します。1 mLのFA-150(150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM EDTA、1% TX-100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム)でビーズを2回洗浄します。 磁気ビーズをFA-150バッファーに再懸濁し、上記のステップ7.3でストックから採取した元の容量まで戻します。各 IP に 7.5 μL を添加します。4°Cで2時間回転しながらインキュベートします。 8. 洗浄と溶出 注:磁気ビーズが乾燥しないように、前回の洗浄液を吸引した後、各洗浄液または溶出バッファーを速やかに加えてください。 毎回0.2〜1 mLの以下の緩衝液を使用してビーズを洗浄します。ビーズを磁気スタンドに集めて、洗浄液を吸引します。各洗浄液を4°Cで5分間、回転しながらインキュベートします。以下の順序に従ってください。FA-150で2回洗ってください。 FA-1M(FA-150 with 1 M NaCl)で1回洗浄してください。 FA-0.5M(FA-150は0.5M NaCl)で1回洗浄する。新しいPCRチューブに移します。 TE-LiCl(250 mM LiCl、10 mM Tris-Cl [pH 8.0]、1 mM EDTA、1% IGEPAL CA-630、1% デオキシコール酸ナトリウム)で1回洗浄します。 TE+(50 mM NaCl、10 mM Tris-Cl [pH 8.0]、1 mM EDTA、0.005% IGEPAL CA-630)で2回洗浄します。注:特に断りのない限り、室温でサンプル処理を続行してください。 最後の洗浄バッファーを吸引します。磁気ビーズを50 μLのChIP溶出バッファー(200 mM NaCl、10 mM Tris-Cl [pH 8.0]、1 mM EDTA、1%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS])で再懸濁し、1.5 mLチューブに移します。 サーモミキサーで65°Cで15分間溶出し、1,000rpmで毎分5秒間混合します。 ビーズを磁気スタンドに集め、上清を新しいチューブに移します。 さらに50 μLのChIP溶出バッファーで溶出を繰り返します。上清を合計100 μLにプールします。 以下に詳述するように、逆架橋とDNA溶出に進みます。 9. 逆架橋とDNA溶出 インプットライセートサンプルを解凍します。最大100 μLにChIP溶出バッファーを補充します。 16.5 μg の RNase A を各 IP およびインプットサンプルに添加します。37°Cで1時間インキュベートします。 40 μgのプロテイナーゼKを添加し、55°Cで2時間インキュベートします。その後、65°Cで一晩インキュベートします。 サンプルを室温まで冷却し、スピンカラムキットでDNAを精製します。 10. qPCR反応のセットアップと実行 注:プライマー、反応セットアップ、およびサーモサイクラーのパラメーターは、使用する qPCR 反応ミックスに関するメーカーの推奨と一致するように変更する必要があります。 GFP RNAiレポーターおよびH3K9me3のポジティブおよびネガティブエンリッチメントコントロール領域を標的とするプライマーセットを調製します。プライマーの融解温度は60°Cです。 プライマー配列については、 材料表 を参照してください。 インプットDNAについては、4倍段階希釈を4回行います(例:1:5、1:20、1:80、1:320)。注:IP DNAは、直接使用することも、希釈(1:2または1:3など)して、より多くの反応を可能にすることもできます。希釈液の適合性は、qPCRの性能に影響を与える可能性があるため、経験的に判断する必要があります。 1つのプライマーセットに対応するすべての反応を1枚のPCRプレートに整理します。各インプットDNA希釈液および各IP DNAサンプルについて、技術的な重複反応を設定します。各10 μLの反応液には、1.5 μLのインプットまたはIP DNA(またはコントロールとしての溶出バッファー)、qPCRマスターミックス(最終濃度1倍)、フォワードプライマー、リバースプライマー(各プライマーの最終濃度400 nM)が含まれています。 リアルタイムサーモサイクラーで、次のプログラムを実行します:初期変性:95°Cで4分間。増幅および蛍光検出:プレート読み取りで95°Cで10秒、60°Cで30秒の40サイクル。最終伸長:60°Cで5分間。融解曲線:60°Cから90°Cまで、0.5°C刻みで、ステップあたり5秒。 11. 増幅効率の決定と製品特異性の検証 入力 DNA 希釈のセットごとに、x 軸に [log10(1/dilution)] 、y 軸に [Input Cq] を使用して、4 つのデータ点をプロットします。最適フィットのラインの傾きを決定します。 増幅効率を計算します。理想的なプライマーセットは、一貫して95%〜100%の効率を示す必要があります。 すべての反応に 1 つの鋭い融解曲線ピークがあり、同じプライマーセットを使用した反応の融解温度が同じであることを確認します。複数のピークまたは異なる融解温度は、非特異的増幅を示している可能性があります。 オプションで、標準的な2%アガロース/TAEゲルで室温で反応させ、生成物のバンドサイズを確認します。 12. インプットのパーセンテージの計算 入力希釈係数を計算します。IP ライセート容量の 10% がインプットとして保存されているため、インプット DNA を 1:5 に希釈した場合の希釈係数は 50 です。 IP希釈係数を決定します。qPCR の前に IP DNA を希釈しない場合、希釈係数は 1 です。 希釈係数を調整した IP と入力の Cq 差を計算します。 入力の割合を計算します。