Эффективный протокол для анализа CUT&RUN изолированных FACS-клеток мыши-сателлитов
Summary
Представлен эффективный протокол выделения клеток-сателлитов мышечных конечностей мышечных конечностей мыши, активируемой флуоресценцией (FACS), адаптированный для изучения регуляции транскрипции в мышечных волокнах путем расщепления под мишенями и высвобождения с помощью нуклеазы (CUT&RUN).
Abstract
Полногеномный анализ малых клеточных популяций является основным препятствием для исследований, особенно в области стволовых клеток. В данной работе описан эффективный протокол выделения клеток-сателлитов из мышцы конечности, ткани с высоким содержанием структурных белков методом флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Рассеченные мышцы конечностей взрослых мышей механически разрушались путем измельчения в среде, дополненной диспазой и коллагеназой I типа. После разложения гомогенат фильтровали через клеточные ситечки, а клетки суспендировали в буфере FACS. Жизнеспособность определяли с помощью фиксируемого окрашивания жизнеспособности, а иммуноокрашенные сателлитные клетки выделяли методом FACS. Клетки лизировали с помощью Triton X-100 и высвободившиеся ядра связывали с магнитными шариками конканавалина А. Комплексы ядро/шарики инкубировали с антителами против интересующего транскрипционного фактора или модификаций гистонов. После промывок комплексы ядро/шарик инкубировали с нуклеазой белка А-микрококковой нуклеазой, а расщепление хроматина инициировали с помощью CaCl2. После экстракции ДНК были созданы и секвенированы библиотеки, а также получены профили связывания полногеномных транскрипционных факторов и ковалентных модификаций гистонов с помощью биоинформатического анализа. Пики, полученные для различных меток гистонов, показали, что события связывания были специфичны для клеток-сателлитов. Более того, анализ известных мотивов показал, что транскрипционный фактор связан с хроматином через родственный ему элемент ответа. Таким образом, этот протокол адаптирован для изучения регуляции генов в клетках-сателлитах мышц конечностей взрослых мышей.
Introduction
Поперечнополосатые мышцы скелета составляют в среднем 40% веса всего тела человека1. Мышечные волокна проявляют замечательную способность к регенерации после травмы, которая описывается слиянием новообразованных миоцитов и генерацией новых миоволокон, заменяющихповрежденные. В 1961 году Александр Мауро сообщил о популяции мононуклеарных клеток, которые он назвал сателлитнымиклетками. Эти стволовые клетки экспрессируют парный блок транскрипционного фактора 7 (PAX7) и расположены между базальной пластинкой и сарколеммой мышечных волокон4. Сообщалось, что они экспрессируют кластер дифференцировки 34 (CD34; гемопоэтический, эндотелиальный предшественник и маркер мезенхимальных стволовых клеток), интегрин альфа 7 (ITGA7; маркер гладкой сердечной и скелетной мускулатуры), а также хемокиновый рецептор C-X-C типа 4 (CXCR4; маркер лимфоцитов, гемопоэтических и сателлитных клеток)5. В базальных условиях клетки-сателлиты находятся в особом микроокружении, которое удерживает их в состоянии покоя6. При повреждении мышц они активизируются, размножаются и подвергаются миогенезу7. Тем не менее, поскольку они составляют лишь незначительную часть от общего числа мышечных клеток, их полногеномный анализ является особенно сложным, особенно в физиологических условиях (<1% от общего количества клеток).
Описаны различные методы выделения хроматина из клеток-сателлитов, которые включают иммунопреципитацию хроматина с последующим массивным параллельным секвенированием (ChIP-seq) или расщеплением по мишеням и мечением (CUT&Tag). Тем не менее, эти два метода имеют некоторые существенные ограничения, которые остаются неоспоримыми. Действительно, ChIP-seq требует большого количества исходного материала для получения достаточного количества хроматина, большая часть которого теряется на этапе ультразвуковой обработки. CUT&Tag больше подходит для малого числа клеток, но генерирует больше нецелевых сайтов расщепления, чем ChIP-seq, из-за активности транспозазы Tn5. Кроме того, поскольку этот фермент обладает высоким сродством к открытым областям хроматина, подход CUT&Tag может быть предпочтительно использован для анализа модификаций гистонов или транскрипционных факторов, связанных с активно транскрибируемыми областями генома, а не с заглушенным гетерохроматином 8,9.
Здесь представлен подробный протокол, который позволяет изолировать сателлитные клетки мышц конечностей мышей с помощью FACS для расщепления под мишенями и высвобождения с помощью анализа нуклеаз (CUT&RUN)10,11. Различные этапы включают в себя механическое разрушение тканей, сортировку клеток и изоляцию ядер. Эффективность метода в отношении получения жизнеспособной клеточной суспензии была продемонстрирована путем проведения CUT&RUN анализа ковалентных модификаций гистонов и транскрипционных факторов. Качество изолированных клеток делает описанный метод особенно привлекательным для получения хроматина, который точно фиксирует нативное состояние занятости генома и, вероятно, будет пригоден для захвата конформации хромосом в сочетании с высокопроизводительным секвенированием в определенных локусах (4C-seq) или на уровне всего генома (Hi-C).
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем исследовании представлен стандартизированный, надежный и простой в исполнении метод выделения и культивирования клеток-сателлитов мышей, а также оценки транскрипционной регуляции методом CUT&RUN.
Этот протокол включает в себя несколько важных шагов. Во-первых…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим Анастасию Баннварт за оказанную техническую помощь. Мы благодарим животноводческий комплекс IGBMC, клеточную культуру, Клинический институт мышей (ICS, Илькирх, Франция), визуализацию, электронную микроскопию, проточную цитометрию и платформу GenomEast, члена консорциума «France Génomique» (ANR-10-INBS-0009).
Данная работа Междисциплинарного тематического института IMCBio, в рамках программы ITI 2021-2028 Страсбургского университета, CNRS и Inserm, была поддержана IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) и проектом SFRI-STRAT’US (ANR 20-SFRI-0012) и EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) в рамках французской программы «Инвестиции в будущее». Дополнительное финансирование было предоставлено INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), стратегической программой AFM-Téléthon 24376 (для D.D.), INSERM для молодых исследователей (для D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT и французским государственным фондом, управляемым ANR в рамках рамочной программы Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. был поддержан программой CDFA-07-22 Франко-аллемандского университета и Министерства высшего образования исследований и инноваций, а также Ассоциацией исследований и инноваций (Association pour la Recherche à l’IGBMC) (ARI).
Materials
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
- Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
- Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
- Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
- Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
- Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
- Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
- Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
- Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
- Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
- Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
- Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
- Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
- Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
- Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
- Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
