Een efficiënt protocol voor CUT&RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen

Dwarsgestreepte skeletspieren vertegenwoordigen gemiddeld 40% van het gewicht van het totale menselijk lichaam¹. Spiervezels vertonen een opmerkelijk vermogen tot regeneratie bij letsel, wat wordt beschreven door de fusie van nieuw gevormde myocyten en de aanmaak van nieuwe myovezels die de beschadigde vervangen². In 1961 rapporteerde Alexander Mauro een populatie van mononucleaire cellen die hij satellietcellen³ noemde. Deze stamcellen brengen de transcriptiefactor gepaarde box 7 (PAX7) tot expressie en bevinden zich tussen de basale lamina en het sarcolemma van spiervezels⁴. Er werd gemeld dat ze het cluster van differentiatie 34 (CD34; een hematopoëtische, endotheliale voorloper en mesenchymale stamcelmarker), integrine alfa 7 (ITGA7; een gladde, hart- en skeletspiermarker) tot expressie brachten, evenals de C-X-C chemokinereceptor type 4 (CXCR4; een lymfocyt-, hematopoëtische en satellietcelmarker)⁵. In basale omstandigheden bevinden satellietcellen zich in een bepaalde micro-omgeving die ze in een rusttoestand houdt⁶. Bij spierbeschadiging worden ze geactiveerd, vermenigvuldigen ze zich en ondergaan ze myogenese⁷. Omdat ze echter slechts een klein deel van het totale aantal spiercellen uitmaken, zijn hun genoombrede analyses bijzonder uitdagend, vooral onder fysiologische omstandigheden (<1% van het totale aantal cellen).

Er zijn verschillende methoden beschreven voor chromatine-isolatie uit satellietcellen, waarbij chromatine-immunoprecipitatie wordt gevolgd door massale parallelle sequencing (ChIP-seq) of splitsing onder doelen en tagmentatie-experimenten (CUT&Tag). Desalniettemin hebben deze twee technieken enkele belangrijke beperkingen die onbetwist blijven. ChIP-seq vereist inderdaad een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal om voldoende chromatine te genereren, waarvan een groot deel verloren gaat tijdens de sonicatiestap. CUT&Tag is meer geschikt voor een laag celaantal, maar genereert meer off-target splitsingsplaatsen dan ChIP-seq vanwege de Tn5-transposase-activiteit. Bovendien, aangezien dit enzym een hoge affiniteit heeft voor open-chromatineregio’s, kan de CUT&Tag-benadering bij voorkeur worden gebruikt voor het analyseren van histonmodificaties of transcriptiefactoren die verband houden met actief getranscribeerde regio’s van het genoom, in plaats van tot zwijgen gebracht heterochromatine ^8,9.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat de isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen door FACS mogelijk maakt voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN)^{10,11-analyse}. De verschillende stappen omvatten de mechanische verstoring van weefsel, celsortering en kernisolatie. De efficiëntie van de methode, met betrekking tot de bereiding van een levensvatbare celsuspensie, werd aangetoond door het uitvoeren van CUT&RUN-analyse voor covalente histonmodificaties en transcriptiefactoren. De kwaliteit van geïsoleerde cellen maakt de beschreven methode bijzonder aantrekkelijk voor het bereiden van chromatine dat de oorspronkelijke genomische bezettingstoestand getrouw vastlegt, en is waarschijnlijk geschikt voor het vastleggen van de chromosoomconformatie in combinatie met high-throughput sequencing op specifieke loci (4C-seq) of op genoombrede niveaus (Hi-C).