Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

I muscoli striati scheletrici rappresentano in media il 40% del peso totale del corpo umano¹. Le fibre muscolari mostrano una notevole capacità di rigenerazione in caso di lesione, che è descritta dalla fusione di miociti di nuova formazione e dalla generazione di nuove miofibre che sostituiscono quelle danneggiate². Nel 1961, Alexander Mauro riportò una popolazione di cellule mononucleate che definì cellule satelliti³. Queste cellule staminali esprimono il fattore di trascrizione 7 (PAX7) e si trovano tra la lamina basale e il sarcolemma delle fibre muscolari⁴. È stato riportato che esprimono il cluster di differenziazione 34 (CD34; un marcatore ematopoietico, progenitore endoteliale e delle cellule staminali mesenchimali), l’integrina alfa 7 (ITGA7; un marcatore del muscolo liscio, cardiaco e scheletrico), nonché il recettore delle chemochine C-X-C di tipo 4 (CXCR4; un marcatore linfocitario, ematopoietico e di cellule satelliti)⁵. In condizioni basali, le cellule satelliti risiedono in un particolare microambiente che le mantiene in uno stato di quiescenza⁶. In caso di danno muscolare, si attivano, proliferano e vanno incontro a miogenesi⁷. Tuttavia, contribuendo solo a una frazione minore del numero totale di cellule muscolari, le loro analisi dell’intero genoma sono particolarmente impegnative, specialmente in contesti fisiologici (<1% delle cellule totali).

Sono stati descritti vari metodi per l’isolamento della cromatina dalle cellule satelliti, che coinvolgono l’immunoprecipitazione della cromatina seguita da massicci esperimenti di sequenziamento parallelo (ChIP-seq) o di scissione sotto bersagli e tagmentazione (CUT&Tag). Tuttavia, queste due tecniche presentano alcuni limiti significativi che rimangono incontestati. Infatti, ChIP-seq richiede un’elevata quantità di materiale di partenza per generare una quantità sufficiente di cromatina, gran parte della quale viene persa durante la fase di sonicazione. CUT&Tag è più appropriato per un basso numero di cellule, ma genera più siti di clivaggio fuori bersaglio rispetto a ChIP-seq a causa dell’attività della trasposasi Tn5. Inoltre, poiché questo enzima ha un’elevata affinità per le regioni a cromatina aperta, l’approccio CUT&Tag potrebbe essere utilizzato preferenzialmente per analizzare le modificazioni istoniche o i fattori di trascrizione associati a regioni del genoma attivamente trascritte, invece dell’eterocromatina^{silenziata 8,9}.

Di seguito viene presentato un protocollo dettagliato che consente l’isolamento delle cellule satelliti muscolari degli arti di topo mediante FACS per la scissione sotto i bersagli e il rilascio utilizzando l’analisi della nucleasi (CUT&RUN)^10,11. Le varie fasi comportano l’interruzione meccanica del tessuto, l’ordinamento cellulare e l’isolamento dei nuclei. L’efficacia del metodo, per quanto riguarda la preparazione di una sospensione cellulare vitale, è stata dimostrata eseguendo l’analisi CUT&RUN per le modificazioni degli istoni covalenti e i fattori di trascrizione. La qualità delle cellule isolate rende il metodo descritto particolarmente interessante per la preparazione della cromatina che cattura fedelmente lo stato di occupazione genomica nativa ed è probabile che sia adatta per catturare la conformazione cromosomica in combinazione con il sequenziamento ad alto rendimento in loci specifici (4C-seq) o a livelli a livello di genoma (Hi-C).