Ein effizientes Protokoll für die CUT&RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Die quergestreifte Skelettmuskulatur macht durchschnittlich 40 % des Gewichts des gesamten menschlichen Körpers aus¹. Muskelfasern weisen eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration nach Verletzungen auf, die durch die Fusion neu gebildeter Myozyten und die Bildung neuer Myofasern beschrieben wird, die die beschädigten ersetzen². Im Jahr 1961 berichtete Alexander Mauro über eine Population von mononukleären Zellen, die er als Satellitenzellen bezeichnete³. Diese Stammzellen exprimieren den Transkriptionsfaktor Pair Box 7 (PAX7) und befinden sich zwischen der Basallamina und dem Sarkolemma der Muskelfasern⁴. Es wurde berichtet, dass sie den Cluster der Differenzierung 34 (CD34; ein hämatopoetischer, endothelialer Vorläufer und mesenchymaler Stammzellmarker), Integrin alpha 7 (ITGA7; ein glatter Marker für Herz- und Skelettmuskeln) sowie den C-X-C-Chemokinrezeptor Typ 4 (CXCR4; ein Lymphozyten-, hämatopoetischer und Satellitenzellmarker) ^{exprimierten5}. Unter basalen Bedingungen befinden sich Satellitenzellen in einer bestimmten Mikroumgebung, die sie in einem Ruhezustand hält⁶. Bei Muskelschäden werden sie aktiviert, vermehren sich und durchlaufen eine Myogenese⁷. Da sie jedoch nur einen kleinen Teil der Gesamtzahl der Muskelzellen ausmachen, sind ihre genomweiten Analysen eine besondere Herausforderung, insbesondere unter physiologischen Bedingungen (<1 % der gesamten Zellen).

Es wurden verschiedene Methoden zur Chromatinisolierung aus Satellitenzellen beschrieben, die eine Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender massiver paralleler Sequenzierung (ChIP-seq) oder Spaltung unter Targets und Tagmentation (CUT&Tag) beinhalten. Nichtsdestotrotz weisen diese beiden Techniken einige erhebliche Einschränkungen auf, die unangefochten bleiben. In der Tat erfordert ChIP-seq eine große Menge an Ausgangsmaterial, um genügend Chromatin zu erzeugen, von dem ein großer Teil während des Beschallungsschritts verloren geht. CUT&Tag eignet sich besser für eine niedrige Zellzahl, erzeugt aber aufgrund der Tn5-Transposase-Aktivität mehr Off-Target-Spaltstellen als ChIP-seq. Da dieses Enzym eine hohe Affinität zu offenen Chromatinregionen aufweist, könnte der CUT&Tag-Ansatz bevorzugt für die Analyse von Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren verwendet werden, die mit aktiv transkribierten Regionen des Genoms assoziiert sind, anstelle von stillgelegtem^{Heterochromatin 8,9}.

Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Isolierung von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaßen mittels FACS für die Spaltung unter den Zielen und die Freisetzung mittels Nuklease-Analyse (CUT&RUN)^10,11 ermöglicht. Die verschiedenen Schritte umfassen den mechanischen Aufschluss des Gewebes, die Zellsortierung und die Zellkernisolierung. Die Effizienz der Methode in Bezug auf die Herstellung einer lebensfähigen Zellsuspension wurde durch die Durchführung von CUT&RUN-Analysen auf kovalente Histonmodifikationen und Transkriptionsfaktoren demonstriert. Die Qualität der isolierten Zellen macht die beschriebene Methode besonders attraktiv für die Herstellung von Chromatin, das den nativen genomischen Belegungszustand originalgetreu erfasst und wahrscheinlich für die Erfassung der Chromosomenkonformation in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierung an spezifischen Loci (4C-seq) oder auf genomweiten Ebenen (Hi-C) geeignet ist.