Summary

Ein effizientes Protokoll für die CUT&RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Published: July 07, 2023
doi:

Summary

Hier wird ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaße vorgestellt, das für die Untersuchung der Transkriptionsregulation in Muskelfasern durch Spaltung unter Targets und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease (CUT&RUN) geeignet ist.

Abstract

Genomweite Analysen mit kleinen Zellpopulationen sind eine große Einschränkung für Studien, insbesondere im Stammzellbereich. Diese Arbeit beschreibt ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Isolierung von Satellitenzellen aus dem Gliedmaßenmuskel, einem Gewebe mit einem hohen Gehalt an Strukturproteinen. Die präparierten Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen wurden mechanisch durch Zerkleinern in Medium, das mit Dispase und Typ-I-Kollagenase ergänzt wurde, gestört. Nach dem Aufschluss wurde das Homogenat durch Zellsiebe filtriert und die Zellen wurden in FACS-Puffer suspendiert. Die Viabilität wurde mit fixierbarer Viabilitätsfärbung bestimmt, und immungefärbte Satellitenzellen wurden mittels FACS isoliert. Die Zellen wurden mit Triton X-100 lysiert und die freigesetzten Zellkerne wurden an Concanavalin-A-Magnetkügelchen gebunden. Die Zellkern-/Bead-Komplexe wurden mit Antikörpern gegen den Transkriptionsfaktor oder die interessierenden Histonmodifikationen inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellkern-/Kügelchenkomplexe mit der Protein-A-Mikrokokken-Nuklease inkubiert und die Chromatinspaltung mit CaCl2 eingeleitet. Nach der DNA-Extraktion wurden Bibliotheken erstellt und sequenziert, und die Profile für die genomweite Transkriptionsfaktorbindung und kovalente Histonmodifikationen wurden durch bioinformatische Analyse erhalten. Die für die verschiedenen Histonmarkierungen erhaltenen Peaks zeigten, dass die Bindungsereignisse spezifisch für Satellitenzellen waren. Darüber hinaus ergab die Analyse bekannter Motive, dass der Transkriptionsfaktor über sein verwandtes Antwortelement an das Chromatin gebunden ist. Dieses Protokoll wurde daher angepasst, um die Genregulation in Satellitenzellen der Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen zu untersuchen.

Introduction

Die quergestreifte Skelettmuskulatur macht durchschnittlich 40 % des Gewichts des gesamten menschlichen Körpers aus1. Muskelfasern weisen eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration nach Verletzungen auf, die durch die Fusion neu gebildeter Myozyten und die Bildung neuer Myofasern beschrieben wird, die die beschädigten ersetzen2. Im Jahr 1961 berichtete Alexander Mauro über eine Population von mononukleären Zellen, die er als Satellitenzellen bezeichnete3. Diese Stammzellen exprimieren den Transkriptionsfaktor Pair Box 7 (PAX7) und befinden sich zwischen der Basallamina und dem Sarkolemma der Muskelfasern4. Es wurde berichtet, dass sie den Cluster der Differenzierung 34 (CD34; ein hämatopoetischer, endothelialer Vorläufer und mesenchymaler Stammzellmarker), Integrin alpha 7 (ITGA7; ein glatter Marker für Herz- und Skelettmuskeln) sowie den C-X-C-Chemokinrezeptor Typ 4 (CXCR4; ein Lymphozyten-, hämatopoetischer und Satellitenzellmarker) exprimierten5. Unter basalen Bedingungen befinden sich Satellitenzellen in einer bestimmten Mikroumgebung, die sie in einem Ruhezustand hält6. Bei Muskelschäden werden sie aktiviert, vermehren sich und durchlaufen eine Myogenese7. Da sie jedoch nur einen kleinen Teil der Gesamtzahl der Muskelzellen ausmachen, sind ihre genomweiten Analysen eine besondere Herausforderung, insbesondere unter physiologischen Bedingungen (<1 % der gesamten Zellen).

Es wurden verschiedene Methoden zur Chromatinisolierung aus Satellitenzellen beschrieben, die eine Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender massiver paralleler Sequenzierung (ChIP-seq) oder Spaltung unter Targets und Tagmentation (CUT&Tag) beinhalten. Nichtsdestotrotz weisen diese beiden Techniken einige erhebliche Einschränkungen auf, die unangefochten bleiben. In der Tat erfordert ChIP-seq eine große Menge an Ausgangsmaterial, um genügend Chromatin zu erzeugen, von dem ein großer Teil während des Beschallungsschritts verloren geht. CUT&Tag eignet sich besser für eine niedrige Zellzahl, erzeugt aber aufgrund der Tn5-Transposase-Aktivität mehr Off-Target-Spaltstellen als ChIP-seq. Da dieses Enzym eine hohe Affinität zu offenen Chromatinregionen aufweist, könnte der CUT&Tag-Ansatz bevorzugt für die Analyse von Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren verwendet werden, die mit aktiv transkribierten Regionen des Genoms assoziiert sind, anstelle von stillgelegtemHeterochromatin 8,9.

Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Isolierung von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaßen mittels FACS für die Spaltung unter den Zielen und die Freisetzung mittels Nuklease-Analyse (CUT&RUN)10,11 ermöglicht. Die verschiedenen Schritte umfassen den mechanischen Aufschluss des Gewebes, die Zellsortierung und die Zellkernisolierung. Die Effizienz der Methode in Bezug auf die Herstellung einer lebensfähigen Zellsuspension wurde durch die Durchführung von CUT&RUN-Analysen auf kovalente Histonmodifikationen und Transkriptionsfaktoren demonstriert. Die Qualität der isolierten Zellen macht die beschriebene Methode besonders attraktiv für die Herstellung von Chromatin, das den nativen genomischen Belegungszustand originalgetreu erfasst und wahrscheinlich für die Erfassung der Chromosomenkonformation in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierung an spezifischen Loci (4C-seq) oder auf genomweiten Ebenen (Hi-C) geeignet ist.

Protocol

Die Mäuse wurden in einem akkreditierten Tierstall gehalten, in Übereinstimmung mit den nationalen Tierpflegerichtlinien (Richtlinie 86/609/EWG der Europäischen Kommission; Französisches Dekret Nr. 87-848) über die Verwendung von Versuchstieren zu Forschungszwecken. Beabsichtigte Manipulationen wurden der Ethikkommission (Com’Eth, Straßburg, Frankreich) und dem französischen Forschungsministerium (MESR) zur ethischen Bewertung und Genehmigung gemäß der Richtlinie 2010/63/EU unter der APAFIS-Nummer #22281 vorgele…

Representative Results

Satellitenzellen aus der Skelettmuskulatur von Mäusen wurden durch die Kombination der Protokolle von Gunther et al. (im Folgenden Protokoll 1)12 und von Liu et al.23 (im Folgenden Protokoll 2) isoliert. Da nicht verdaute Muskelfasern nach der Verdauung beobachtet wurden, wenn die in Protokoll 1 vorgeschlagene Konzentration von Kollagenase und Dispase verwendet wurde, wurde die Menge der Enzyme erhöht, um die Dissoziation der Muskelfasern zu verbessern, wie in den Schritt…

Discussion

Die vorliegende Studie berichtet über eine standardisierte, zuverlässige und einfach durchzuführende Methode zur Isolierung und Kultivierung von Maus-Satellitenzellen sowie zur Beurteilung der Transkriptionsregulation durch die CUT&RUN-Methode.

Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Die erste ist der Muskelaufschluss und die Verdauung von Ballaststoffen, um eine hohe Anzahl gesammelter Zellen zu gewährleisten. Trotz der erhöhten Enzymkonzentration wurden mehr lebende Zellen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Anastasia Bannwarth für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken dem IGBMC-Tierstall, der Zellkultur, dem Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankreich), der Bildgebung, der Elektronenmikroskopie, der Durchflusszytometrie und der GenomEast-Plattform, einem Mitglied des “France Génomique”-Konsortiums (ANR-10-INBS-0009).

Diese Arbeit des Interdisziplinären Thematischen Instituts IMCBio im Rahmen des ITI-Programms 2021-2028 der Universität Straßburg, CNRS und Inserm wurde von IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) und vom Projekt SFRI-STRAT’US (ANR 20-SFRI-0012) und EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) im Rahmen des französischen Programms “Investitionen in die Zukunft” unterstützt. Weitere Mittel wurden von INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), dem AFM-Téléthon Strategic Program 24376 (an D.D.), INSERM Young Researcher Grant (an D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT und einem französischen Staatsfonds bereitgestellt, der von der ANR im Rahmen des Rahmenprogramms Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02) verwaltet wird. J.R. wurde durch das Programm CDFA-07-22 der Université franco-allemande und des Ministère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’Innovation und K.G. durch die Association pour la Recherche à l’IGBMC (ARI) unterstützt.

Materials

1.5 mL microtube Eppendorf 2080422
2 mL microtube Star Lab S1620-2700
5 mL tubes CORNING-FALCON 352063
50 mL tubes Falcon 352098
anti-AR abcam ab108341
anti-CD11b eBioscience 25-0112-82
anti-CD31 eBioscience 12-0311-82
anti-CD34 eBioscience 48-0341-82
anti-CD45 eBioscience 12-0451-83
anti-CXCR4 eBioscience 17-9991-82
anti-DMD abcam ab15277
anti-H3K27ac Active Motif 39133
anti-H3K4me2 Active Motif 39141
anti-ITGA7 MBL k0046-4
anti-PAX7 DSHB AB_528428
anti-TER119 BD Pharmingen TM 553673
Beads Polysciences 86057-3 BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm Corning®  431752
Cell Strainer 40 µm Corning®  431750
Cell Strainer 70 µm Corning®  431751
Centrifuge 1 Eppendorf 521-0011 Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2 Eppendorf 5805000010 Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System  ThermoFischer 171080 Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent Sigma   SLBQ7780V RNaseZAPTM
Collagenase, type I  Thermo Fisher 17100017 10 mg/mL
Dispase  STEMCELL technologies 7913 5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant Invitrogen 12321D
Fixable Viability Stain BD Biosciences 565388
Flow cytometer BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer 23-14816-01
Fluoromount G with DAPI Invitrogen 00-4959-52
Genome browser  IGV http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol  Sigma-Aldrich G9012
Hydrogel Corning®  354277 Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software Image J® V 1.8.0
Laboratory film Sigma-Aldrich P7793-1EA PARAFILM® M
Liberase LT Roche 5401020001
Propyl gallate Sigma-Aldrich 2370
Sequencer  Illumina Hiseq 4000 SY-401-4001
Shaking water bath Bioblock Scientific polytest 20 18724

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

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Ghaibour, K., Rizk, J., Ebel, C., Ye, T., Philipps, M., Schreiber, V., Metzger, D., Duteil, D. An Efficient Protocol for CUT&RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells. J. Vis. Exp. (197), e65215, doi:10.3791/65215 (2023).

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