بروتوكول فعال لتحليل CUT&RUN لخلايا الأقمار الصناعية للفأر المعزولة FACS
Summary
يظهر هنا بروتوكول فعال لعزل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفأر التي تم تكييفها لدراسة تنظيم النسخ في ألياف العضلات عن طريق الانقسام تحت الأهداف وإطلاقها باستخدام النيوكلياز (CUT &RUN).
Abstract
تشكل التحليلات على مستوى الجينوم مع مجموعات الخلايا الصغيرة عائقا رئيسيا للدراسات ، لا سيما في مجال الخلايا الجذعية. يصف هذا العمل بروتوكولا فعالا لعزل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية من عضلة الأطراف ، وهي نسيج يحتوي على نسبة عالية من البروتينات الهيكلية. تم تعطيل عضلات الأطراف المشرحة من الفئران البالغة ميكانيكيا عن طريق الفرم في وسط مكمل بالكولاجين من النوع الأول. عند الهضم ، تم ترشيح التجانس من خلال مصافي الخلايا ، وتم تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS. تم تحديد الصلاحية مع صبغة قابلة للتثبيت ، وتم عزل الخلايا الساتلية الملطخة بالمناعة بواسطة FACS. تم تحليل الخلايا باستخدام Triton X-100 وكانت النوى المنبعثة مرتبطة بخرز كونكانافالين أ المغناطيسي. تم تحضين معقدات النواة / الخرز بأجسام مضادة ضد عامل النسخ أو تعديلات الهستون ذات الأهمية. بعد الغسلات ، تم تحضين معقدات النواة / الخرز ببروتين A-micrococcal nuclease ، وبدأ انقسام الكروماتين باستخدام CaCl2. بعد استخراج الحمض النووي ، تم إنشاء المكتبات وتسلسلها ، وتم الحصول على ملفات تعريف ارتباط عامل النسخ على مستوى الجينوم وتعديلات الهستون التساهمي عن طريق التحليل المعلوماتي الحيوي. أظهرت القمم التي تم الحصول عليها لمختلف علامات الهستون أن أحداث الارتباط كانت خاصة بالخلايا الساتلية. علاوة على ذلك ، كشف تحليل الزخارف المعروف أن عامل النسخ كان مرتبطا بالكروماتين عبر عنصر الاستجابة المماثل. لذلك تم تكييف هذا البروتوكول لدراسة التنظيم الجيني في الخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفئران البالغة.
Introduction
تمثل العضلات المخططة الهيكلية في المتوسط 40٪ من وزن إجمالي جسم الإنسان1. تظهر ألياف العضلات قدرة ملحوظة على التجدد عند الإصابة ، والتي توصف باندماج الخلايا العضلية المشكلة حديثا وتوليد ألياف عضلية جديدة تحل محل الخلايا التالفة2. في عام 1961 ، أبلغ ألكسندر ماورو عن مجموعة من الخلايا أحادية النواة التي أطلق عليها اسم خلايا الأقمار الصناعية3. تعبر هذه الخلايا الجذعية عن عامل النسخ المقترن بالمربع 7 (PAX7) ، وتقع بين الصفيحة القاعدية وساركوليما الألياف العضلية4. تم الإبلاغ عن أنها تعبر عن مجموعة التمايز 34 (CD34 ؛ علامة الخلايا الجذعية المكونة للدم ، البطانية ، وعلامة الخلايا الجذعية الوسيطة) ، و integrin alpha 7 (ITGA7 ؛ علامة العضلات الملساء والقلبية والهيكل العظمي) ، بالإضافة إلى مستقبلات chemokine من النوع 4 (CXCR4 ؛ علامة الخلايا الليمفاوية ، المكونة للدم ، والخلايا الساتلية)5. في الظروف القاعدية ، توجد الخلايا الساتلية في بيئة دقيقة معينة تبقيها في حالة هادئة6. عند تلف العضلات ، يتم تنشيطها وتكاثرها وتخضع لتكوين العضلات7. ومع ذلك ، لا تساهم سوى جزء صغير من إجمالي عدد خلايا العضلات ، فإن تحليلاتها على مستوى الجينوم تمثل تحديا خاصا ، خاصة في ظل الإعدادات الفسيولوجية (<1٪ من إجمالي الخلايا).
تم وصف طرق مختلفة لعزل الكروماتين من الخلايا الساتلية ، والتي تنطوي على الترسيب المناعي للكروماتين متبوعا بالتسلسل المتوازي الهائل (ChIP-seq) أو الانقسام تحت تجارب الأهداف ووضع العلامات (CUT &Tag). ومع ذلك ، فإن هاتين التقنيتين تمثلان بعض القيود المهمة التي لا تزال دون منازع. في الواقع ، يتطلب ChIP-seq كمية كبيرة من مواد البدء لتوليد ما يكفي من الكروماتين ، حيث يتم فقد نسبة كبيرة منه أثناء خطوة الصوتنة. يعد CUT &Tag أكثر ملاءمة لعدد الخلايا المنخفض ، ولكنه يولد مواقع انقسام خارج الهدف أكثر من ChIP-seq بسبب نشاط ترانسبوزاز Tn5. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هذا الإنزيم له تقارب كبير لمناطق الكروماتين المفتوحة ، يمكن استخدام نهج CUT &Tag بشكل تفضيلي لتحليل تعديلات الهستون أو عوامل النسخ المرتبطة بالمناطق المنسوخة بنشاط من الجينوم ، بدلا من تغاير كروماتين 8,9 الصامت.
يظهر هنا بروتوكول مفصل يسمح بعزل الخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفأر بواسطة FACS للانقسام تحت الأهداف وإطلاقها باستخدام تحليل nuclease (CUT &RUN) 10,11. تتضمن الخطوات المختلفة الاضطراب الميكانيكي للأنسجة وفرز الخلايا وعزل النوى. تم إثبات كفاءة الطريقة ، فيما يتعلق بإعداد تعليق خلية قابل للحياة ، من خلال إجراء تحليل CUT &RUN لتعديلات الهستون التساهمي وعوامل النسخ. تجعل جودة الخلايا المعزولة الطريقة الموصوفة جذابة بشكل خاص لإعداد الكروماتين الذي يلتقط حالة الإشغال الجينومي الأصلية بأمانة ، ومن المحتمل أن يكون مناسبا لالتقاط تشكل الكروموسوم مع التسلسل عالي الإنتاجية في مواقع محددة (4C-seq) أو على مستويات الجينوم على نطاق واسع (Hi-C).
Protocol
Representative Results
Discussion
تشير الدراسة الحالية إلى طريقة موحدة وموثوقة وسهلة الأداء لعزل وثقافة خلايا الأقمار الصناعية للفأر ، بالإضافة إلى تقييم تنظيم النسخ بواسطة طريقة CUT &RUN.
يتضمن هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الأول هو اضطراب العضلات وهضم الألياف لضمان وجود عدد كبير من الخلايا المجمعة. على ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أناستازيا بانوارث على تقديم المساعدة الفنية الممتازة. نشكر مرفق بيت IGBMC ، وثقافة الخلايا ، ومعهد الماوس السريري (ICS ، Illkirch ، فرنسا) ، والتصوير ، والمجهر الإلكتروني ، وقياس التدفق الخلوي ، ومنصة GenomEast ، وهي عضو في اتحاد “France Génomique” (ANR-10-INBS-0009).
تم دعم هذا العمل للمعهد المواضيعي متعدد التخصصات IMCBio ، كجزء من برنامج ITI 2021-2028 لجامعة ستراسبورغ و CNRS و Inserm ، من قبل IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ومشروع SFRI-STRAT’US (ANR 20-SFRI-0012) و EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) في إطار برنامج الاستثمارات الفرنسية من أجل المستقبل. تم تقديم تمويل إضافي من قبل INSERM و CNRS و Unistra و IGBMC والوكالة الوطنية للبحوث (ANR-16-CE11-0009 ، AR2GR) والبرنامج الاستراتيجي AFM-Téléthon 24376 (إلى D.D.) ومنحة INSERM للباحثين الشباب (إلى D.D.) و ANR-10-LABX-0030-INRT وصندوق حكومي فرنسي تديره ANR في إطار برنامج Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). وتلقى ج. ر. الدعم من برنامج CDFA-07-22 من الجامعة الفرنسية ووزارة التعليم العالي للبحوث والابتكار، ومن قبل جمعية البحوث والبحوث والابتكار (IGBMC).
Materials
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
- Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
- Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
- Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
- Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
- Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
- Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
- Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
- Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
- Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
- Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
- Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
- Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
- Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
- Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
- Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
