פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC
Summary
מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN).
Abstract
ניתוחים גנומיים עם אוכלוסיות תאים קטנות הם אילוץ מרכזי למחקרים, במיוחד בתחום תאי הגזע. עבודה זו מתארת פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין משריר הגפיים, רקמה עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי גפיים מנותחים מעכברים בוגרים שובשו מכנית על ידי טחינה במדיום בתוספת דיספאס וקולגנאז מסוג I. עם העיכול, ההומוגנט סונן דרך מסננות תאים, והתאים הושעו במאגר FACS. הכדאיות נקבעה עם כתם כדאיות הניתן לתיקון, ותאי לוויין מוכתמים חיסונית בודדו על ידי FACS. התאים עברו ליזה עם Triton X-100 וגרעינים ששוחררו נקשרו לחרוזים מגנטיים מסוג concanavalin A. קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם נוגדנים כנגד גורם השעתוק או שינויי ההיסטון המעניינים. לאחר השטיפה, קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם חלבון A-micrococcal nuclease, ומחשוף הכרומטין החל עם CaCl2. לאחר מיצוי הדנ”א נוצרו ורוצפו ספריות, והפרופילים לקשירת פקטורי שעתוק ברחבי הגנום ושינויים קוולנטיים בהיסטון התקבלו על ידי אנליזה ביואינפורמטית. הפסגות שהתקבלו עבור סימני ההיסטון השונים הראו כי אירועי הקישור היו ספציפיים לתאי לוויין. יתר על כן, ניתוח מוטיב ידוע גילה כי גורם השעתוק קשור לכרומטין באמצעות אלמנט התגובה הקוגנטית שלו. פרוטוקול זה מותאם אפוא לחקר בקרת גנים בתאי לוויין של שרירי גפיים של עכברים בוגרים.
Introduction
שרירי השלד המפוספסים מייצגים בממוצע 40% ממשקל גוף האדם הכולל1. סיבי שריר מפגינים יכולת יוצאת דופן להתחדשות בעת פציעה, המתוארת על ידי איחוי של מיוציטים חדשים שנוצרו ויצירת מיוסיבים חדשים המחליפים את הפגועים2. בשנת 1961 דיווח אלכסנדר מאורו על אוכלוסייה של תאים חד-גרעיניים שאותם כינה תאי לוויין3. תאי גזע אלה מבטאים את פקטור השעתוק בתיבה 7 (PAX7), וממוקמים בין הלמינה הבסיסית לבין הסרקולמה של סיבי שריר4. הם דווחו כמבטאים את אשכול ההתמיינות 34 (CD34; אב המטופוייטי, אנדותל וסמן תאי גזע מזנכימליים), אינטגרין אלפא 7 (ITGA7; סמן שרירי לב ושלד חלקים), כמו גם קולטן כימוקין C-X-C מסוג 4 (CXCR4; סמן לימפוציטים, המטופויטים ותאי לוויין)5. בתנאי בסיס, תאי לוויין שוכנים במיקרו-סביבה מסוימת השומרת אותם במצב שקט6. עם פגיעה בשרירים, הם הופכים מופעלים, מתרבים ועוברים מיוגנזה7. עם זאת, הם תורמים רק לחלק קטן מכלל תאי השריר, והניתוחים הכלל-גנומיים שלהם מאתגרים במיוחד, במיוחד בתנאים פיזיולוגיים (<1% מכלל התאים).
תוארו שיטות שונות לבידוד כרומטין מתאי לוויין, הכוללות משקעים חיסוניים של כרומטין ואחריו ריצוף מקבילי מסיבי (ChIP-seq) או מחשוף תחת ניסויי מטרות ותיוג (CUT&Tag). עם זאת, שתי טכניקות אלה מציגות כמה מגבלות משמעותיות שנותרו ללא עוררין. ואכן, ChIP-seq דורש כמות גבוהה של חומר מוצא כדי לייצר מספיק כרומטין, שחלק גדול ממנו הולך לאיבוד במהלך שלב הסוניקציה. CUT&Tag מתאים יותר למספר תאים נמוך, אך מייצר יותר אתרי מחשוף מחוץ למטרה מאשר ChIP-seq בשל פעילות טרנספוזאז Tn5. בנוסף, מאחר שלאנזים זה יש זיקה גבוהה לאזורים עם כרומטין פתוח, גישת CUT&Tag עשויה לשמש לניתוח שינויים בהיסטון או גורמי שעתוק הקשורים לאזורים משועתקים באופן פעיל של הגנום, במקום הטרוכרומטיןמושתק 8,9.
מוצג כאן פרוטוקול מפורט המאפשר בידוד של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים על ידי FACS עבור מחשוף מתחת למטרות ושחרור באמצעות ניתוח נוקלאז (CUT&RUN)10,11. השלבים השונים כרוכים בשיבוש מכני של רקמות, מיון תאים ובידוד גרעינים. יעילות השיטה, בכל הנוגע להכנת תרחיף תאים בר קיימא, הודגמה על ידי ביצוע ניתוח CUT&RUN עבור שינויים קוולנטיים בהיסטון וגורמי שעתוק. איכותם של התאים המבודדים הופכת את השיטה המתוארת לאטרקטיבית במיוחד להכנת כרומטין הלוכד נאמנה את מצב התפוסה הגנומי הטבעי, ועשוי להתאים ללכידת קונפורמציית הכרומוזומים בשילוב עם ריצוף בתפוקה גבוהה במוקדים ספציפיים (4C-seq) או ברמות רחבות גנום (Hi-C).
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הנוכחי מדווח על שיטה סטנדרטית, אמינה וקלה לביצוע לבידוד ותרבית של תאי לוויין עכברים, כמו גם על הערכת ויסות שעתוק בשיטת CUT&RUN.
פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים. הראשון הוא הפרעה בשרירים ועיכול סיבים כדי להבטיח מספר גבוה של תאים שנאספו. למרות ריכוז האנזימים המוגבר, התק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאנסטסיה באנווארת על מתן סיוע טכני מעולה. אנו מודים למתקן בית החיות IGBMC, לתרבית התא, למכון הקליני לעכברים (ICS, אילקירך, צרפת), להדמיה, למיקרוסקופ האלקטרונים, לציטומטריית הזרימה ולפלטפורמת GenomEast, חברה בקונסורציום ‘France Génomique’ (ANR-10-INBS-0009).
עבודה זו של המכון התמטי הבינתחומי IMCBio, כחלק מתוכנית ITI 2021-2028 של אוניברסיטת שטרסבורג, CNRS ו- Inserm, נתמכה על ידי IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ועל ידי פרויקט SFRI-STRAT’US (ANR 20-SFRI-0012) ו- EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) במסגרת תוכנית ההשקעות הצרפתית לעתיד. מימון נוסף הועבר על ידי INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), התוכנית האסטרטגית AFM-Téléthon 24376 (ל- D.D.), INSERM מענק חוקר צעיר (ל- D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, וקרן ממשלתית צרפתית המנוהלת על ידי ANR במסגרת תוכנית Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. נתמך על ידי התוכנית CDFA-07-22 של אוניברסיטת פרנקו-אלמנדה ו Ministère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’Innovation, ו K.G. על ידי האגודה pour la Recherche à l’IGBMC (ARI).
Materials
| 1.5 mL microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 mL microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 mL tubes | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| anti-AR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| anti-CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| anti-CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| anti-CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| anti-CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| anti-DMD | abcam | ab15277 | |
| anti-H3K27ac | Active Motif | 39133 | |
| anti-H3K4me2 | Active Motif | 39141 | |
| anti-ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| anti-PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| anti-TER119 | BD Pharmingen TM | 553673 | |
| Beads | Polysciences | 86057-3 | BioMag®Plus Concanavalin A |
| Cell Strainer 100 µm | Corning® | 431752 | |
| Cell Strainer 40 µm | Corning® | 431750 | |
| Cell Strainer 70 µm | Corning® | 431751 | |
| Centrifuge 1 | Eppendorf | 521-0011 | Centrifuge 5415 R |
| Centrifuge 2 | Eppendorf | 5805000010 | Centrifuge 5804 R |
| Chamber Slide System | ThermoFischer | 171080 | Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide |
| Cleaning agent | Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM |
| Collagenase, type I | Thermo Fisher | 17100017 | 10 mg/mL |
| Dispase | STEMCELL technologies | 7913 | 5 U/mL |
| DynaMag™-2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | 565388 | |
| Flow cytometer | BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| Genome browser | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hydrogel | Corning® | 354277 | Matrigel hESC qualified matrix |
| Image processing software | Image J® | V 1.8.0 | |
| Laboratory film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM® M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| Shaking water bath | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
- Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
- Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
- Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
- Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
- Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
- Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
- Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
- Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
- Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
- Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
- Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
- Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
- Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
- Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
- Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
