Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

Os músculos estriados esqueléticos representam, em média, 40% do peso total do corpo humano¹. As fibras musculares exibem notável capacidade de regeneração após a lesão, que é descrita pela fusão de miócitos neoformados e pela geração de novas miofibras que substituem as^lesadas2. Em 1961, Alexander Mauro relatou uma população de células mononucleares que denominou como células satélites³. Essas células-tronco expressam o fator de transcrição pareado caixa 7 (PAX7) e estão localizadas entre a lâmina basal e o sarcolema das fibras^musculares4. Foi relatado que eles expressam o cluster de diferenciação 34 (CD34; um marcador hematopoiético, progenitor endotelial e de células-tronco mesenquimais), integrina alfa 7 (ITGA7; um marcador liso, cardíaco e músculo esquelético), bem como o receptor de quimiocina C-X-C tipo 4 (CXCR4; um marcador de linfócitos, hematopoiéticos e células satélites)⁵. Em condições basais, as células satélites residem em um microambiente particular que as mantém em estado^quiescente6. Com o dano muscular, tornam-se ativados, proliferam e sofrem miogênese⁷. No entanto, contribuindo apenas para uma pequena fração do número total de células musculares, suas análises genômicas são particularmente desafiadoras, especialmente em ambientes fisiológicos (<1% do total de células).

Vários métodos para isolamento de cromatina a partir de células satélites têm sido descritos, os quais envolvem imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento paralelo maciço (ChIP-seq) ou clivagem sob alvos e experimentos de tagmentação (CUT&Tag). No entanto, essas duas técnicas apresentam algumas limitações significativas que permanecem incontestadas. De fato, ChIP-seq requer uma alta quantidade de material de partida para gerar cromatina suficiente, uma grande proporção da qual é perdida durante a etapa de sonicação. CUT&Tag é mais apropriado para baixo número de células, mas gera mais locais de clivagem fora do alvo do que ChIP-seq devido à atividade de transposição Tn5. Além disso, como essa enzima tem alta afinidade por regiões de cromatina aberta, a abordagem CUT&Tag pode ser preferencialmente usada para analisar modificações de histonas ou fatores de transcrição associados a regiões ativamente transcritas do genoma, em vez de heterocromatina silenciada ^8,9.

Apresenta-se aqui um protocolo detalhado que permite o isolamento de células satélites musculares de membros de camundongos por FACS para clivagem sob alvos e liberação utilizando análise de nucleases (CUT&RUN)^10,11. As várias etapas envolvem a ruptura mecânica do tecido, a classificação celular e o isolamento dos núcleos. A eficiência do método, no que se refere à preparação de uma suspensão celular viável, foi demonstrada através da análise CUT&RUN para modificações de histonas covalentes e fatores de transcrição. A qualidade das células isoladas torna o método descrito particularmente atraente para a preparação de cromatina que captura fielmente o estado de ocupação genômica nativa, e é provável que seja adequado para capturar a conformação cromossômica em combinação com o sequenciamento de alto rendimento em loci específicos (4C-seq) ou em níveis genômicos amplos (Hi-C).