Un protocolo eficiente para el análisis CUT&RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Los músculos estriados esqueléticos representan en promedio el 40% del peso total del cuerpo humano¹. Las fibras musculares exhiben una notable capacidad de regeneración ante una lesión, que se describe por la fusión de miocitos recién formados y la generación de nuevas miofibras que reemplazan a las dañadas². En 1961, Alexander Mauro reportó una población de células mononucleares a las que denominó células satélite³. Estas células madre expresan el factor de transcripción pareado box 7 (PAX7), y se localizan entre la lámina basal y el sarcolema de las fibras musculares⁴. Se informó que expresan el grupo de diferenciación 34 (CD34; un marcador hematopoyético, progenitor endotelial y de células madre mesenquimales), la integrina alfa 7 (ITGA7; un marcador del músculo liso, cardíaco y esquelético), así como el receptor de quimiocinas C-X-C tipo 4 (CXCR4; un marcador linfocítico, hematopoyético y de células satélite)⁵. En condiciones basales, las células satélite residen en un microambiente particular que las mantiene en un estado de reposo⁶. Tras el daño muscular, se activan, proliferan y sufren miogénesis⁷. Sin embargo, al contribuir solo a una pequeña fracción del número total de células musculares, sus análisis de todo el genoma son particularmente desafiantes, especialmente en entornos fisiológicos (<1% del total de células).

Se han descrito varios métodos para el aislamiento de la cromatina a partir de células satélite, que implican la inmunoprecipitación de la cromatina seguida de la secuenciación paralela masiva (ChIP-seq) o los experimentos de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag). Sin embargo, estas dos técnicas presentan algunas limitaciones significativas que permanecen incuestionables. De hecho, ChIP-seq requiere una gran cantidad de material de partida para generar suficiente cromatina, una gran parte de la cual se pierde durante la etapa de sonicación. CUT&Tag es más apropiado para un número bajo de células, pero genera más sitios de escisión fuera del objetivo que ChIP-seq debido a la actividad de la transposasa Tn5. Además, dado que esta enzima tiene una alta afinidad por las regiones de cromatina abierta, el enfoque CUT&Tag podría utilizarse preferentemente para analizar las modificaciones de histonas o los factores de transcripción asociados con regiones del genoma transcritas activamente, en lugar de la heterocromatina silenciada ^8,9.

A continuación se presenta un protocolo detallado que permite el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón mediante FACS para su escisión bajo dianas y su liberación mediante el análisis de nucleasa (CUT&RUN)^10,11. Los diversos pasos implican la alteración mecánica del tejido, la clasificación celular y el aislamiento de núcleos. La eficacia del método, en cuanto a la preparación de una suspensión celular viable, se demostró mediante la realización de análisis CUT&RUN para modificaciones covalentes de histonas y factores de transcripción. La calidad de las células aisladas hace que el método descrito sea particularmente atractivo para preparar cromatina que capture fielmente el estado de ocupación genómica nativa, y es probable que sea adecuado para capturar la conformación cromosómica en combinación con la secuenciación de alto rendimiento en loci específicos (4C-seq) o a niveles de todo el genoma (Hi-C).