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Bioengineering

Fabbricazione di microparticelle polimeriche pulsatili che incapsulano l'antigene della rabbia

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65147
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1Department of Bioengineering,Rice University, 2Particles for Humanity, 3IMPACT Technology Development, 4Department of Chemistry,Rice University

Summary

Questo metodo descrive l’incapsulamento dell’antigene della rabbia in microparticelle polimeriche biodegradabili con proprietà strutturali e materiali che consentono il rilascio di pulsatili dopo un ritardo predeterminato. La valutazione ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) dell’antigene recuperato dal nucleo delle particelle conferma la presenza di glicoproteina intatta del virus della rabbia trimerica attraverso la fabbricazione di particelle.

Abstract

Le attuali linee guida per la profilassi post-esposizione alla rabbia richiedono iniezioni multiple somministrate per diverse settimane. Ciò può essere sproporzionatamente oneroso per coloro che vivono in paesi a basso e medio reddito (LMIC), dove si verifica la maggior parte delle esposizioni mortali alla rabbia. Sono state esplorate diverse strategie di somministrazione di farmaci per condensare i regimi vaccinali in una singola iniezione incapsulando antigeni in particelle polimeriche. Tuttavia, forti fattori di stress durante il processo di incapsulamento possono causare la denaturazione dell’antigene incapsulato. Questo articolo descrive un metodo per incapsulare l’antigene del virus della rabbia (RABV) in microparticelle polimeriche che mostrano un rilascio pulsatile sintonizzabile. Questo metodo, denominato Particelle uniformemente liquefatte e sigillate per incapsulare farmaci (PULSED), genera microparticelle utilizzando la litografia morbida per creare stampi di polidimetilsilossano inverso (PDMS) da uno stampo master stampato in 3D multi-fotone. I film di poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) vengono quindi stampati a compressione negli stampi PDMS per generare cilindri a faccia aperta riempiti con RABV concentrato utilizzando un robot di erogazione piezoelettrico. Queste microstrutture vengono quindi sigillate riscaldando la parte superiore delle particelle, consentendo al materiale di fluire e formare una barriera polimerica continua e non porosa. Dopo la fabbricazione, un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) specifico per la rilevazione della glicoproteina intatta del virus della rabbia trimerica viene utilizzato per confermare l’elevato recupero dell’antigene immunogenico dalle microparticelle.

Introduction

La vaccinazione è uno strumento sanitario estremamente efficace, avendo prevenuto oltre 37 milioni di decessi tra il 2000 e il 20191. Nonostante questa efficacia, le malattie prevenibili con i vaccini continuano a rappresentare un rischio significativo per la salute globale, specialmente nei paesi a basso e medio reddito (LMIC) dove alti tassi di non- e sotto-vaccinazione contribuiscono a 1,5 milioni di decessi prevenibili con vaccino ogni anno2. La rabbia non fa eccezione a queste disparità. Nonostante il suo status di malattia più mortale conosciuta dall’umanità, essendo quasi universalmente fatale, la rabbia è completamente curabile ed è classificata come sradicata in molti paesi ad alto reddito. Invece, il peso della rabbia è sopportato in modo sproporzionato dalle persone che vivono in alcune parti dell’Asia e dell’Africa, dove la malattia ha esiti devastanti sull’uomo e sul bestiame 3,4.

La vaccinazione è fondamentale per gestire l’impatto globale della rabbia5. Il costo della vaccinazione impedisce l’implementazione diffusa della profilassi pre-esposizione (PrEP), considerando la bassa incidenza complessiva della malattia. Inoltre, nei LMIC, l’utilità della profilassi post-esposizione (PEP) è limitata dalle pressioni socioeconomiche sui pazienti che cercano assistenza sanitaria. Fattori logistici, come la distanza di viaggio verso i punti di accesso all’assistenza sanitaria, la perdita di salari durante l’ottenimento delle cure, il costo del trattamento, gli appuntamenti che interferiscono con le attività quotidiane e la dimenticanza, portano a tassi di aderenza al PEP fino al 60%6,7. Questo alto tasso di abbandono dei pazienti rappresenta un’opportunità per perfezionare gli approcci per affrontare le lacune nella vaccinazione antirabbica al fine di combattere la malattia.

I sistemi di vaccinazione a iniezione singola (SI) che controllano il rilascio di antigeni sono stati esplorati come modi per ottenere l’immunizzazione completa in un’unica iniezione. L’eliminazione della necessità di visite multiple a un operatore sanitario mitiga gli oneri che impediscono alle persone di cercare cure adeguate. Per ottenere la vaccinazione SI, un antigene è tipicamente incapsulato all’interno di una matrice polimerica biodegradabile che spesso assume la forma di microparticelle iniettabili. Una volta iniettato, il polimero si degrada e rilascia l’antigene sequestrato. Ad oggi, sono state perseguite due strategie di rilascio primario per ottenere la vaccinazione sacroiliaca. In un approccio, l’antigene viene rilasciato continuamente per un lungo periodo di tempo. Sebbene sia destinato a migliorare l’immunogenicità di una singola iniezione, non è chiaro se questo approccio sia sufficiente a suscitare una risposta immunitaria protettiva contro il virus della rabbia (RABV) nell’uomo8. Nell’altro, l’antigene viene rilasciato dopo un ritardo predeterminato per imitare un regime vaccinale convenzionale e comprovato prime-boost. I metodi di essiccazione a spruzzo e di fabbricazione di microparticelle basati sull’evaporazione di emulsioni / solventi mostrano la prima strategia e sono stati utilizzati per incapsulare con successo sia i vaccini modello9 che gli antigeni altamente stabili, come il tossoide tetanico10. Tuttavia, questi metodi di incapsulamento coinvolgono fattori di stress, tra cui calore, interazione con solventi e forze fisiche, che possono denaturare gli antigeni11.

Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED) è un metodo di fabbricazione recentemente sviluppato che può essere impiegato per incapsulare farmaci biologici in microparticelle biodegradabili. Il microstampaggio viene utilizzato per generare particelle che vengono riempite con un carico utile liquido e riscaldate per consentire al polimero di rifluire e incapsulare completamente il deposito centrale del carico all’interno di uno strato contiguo del polimero biodegradabile. Questa microstruttura provoca il rilascio pulsatile del carico utile, dopo una durata che dipende dalla velocità di degradazione del guscio polimerico12. Questo manoscritto dimostra l’incapsulamento di RABV inattivato all’interno di microparticelle composte da acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA), un polimero biodegradabile utilizzato in molte formulazioni approvate dalla FDA13, utilizzando il metodo di fabbricazione PULSED per incapsulare l’antigene RABV stabile valutato da un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Combinando particelle di PLGA con diversi gruppi di peso molecolare e/o terminale, questo approccio ha il potenziale per imitare l’attuale ciclo di vaccinazione antirabbica dopo una singola iniezione.

Protocol

1. Generazione dello stampo principale delle particelle NOTA: Il processo di stampa 3D può essere eseguito con qualsiasi stampante 3D con una risoluzione spaziale sufficiente; tuttavia, il protocollo attuale descrive il processo per una stampante 3D multi-fotone. Progettare strutture di microparticelle utilizzando un programma CAD (computer-aided design).NOTA: Le specifiche di progettazione sono le seguenti: 308 particelle (diametro = 400 μm, altezza = 500 μm e spessore della parete = 100 μm) sono disposte in una matrice 22 per 14, con 600 μm di spaziatura tra di loro. Il disegno contiene anche una stella a quattro punte e una stella a cinque punte come fiduciali immediatamente al di fuori dell’array (Figura supplementare 1). Esportare il progetto finale come file STL (Supplementary Coding File 1) e caricare il file su software in grado di definire i parametri di stampa come mostrato di seguito. Quindi, salvalo come file compatibile con la stampante 3D (vedi Tabella dei materiali).NOTA: Distanza di taglio = 5 μm, distanza di tratteggio = 1 μm, contorno del guscio = 50 μm, numero di fette di base = 5 μm, impalcatura = cavo, modalità di scansione = galvo, asse z = microscopio z-drive, velocità di scansione = 100.000, potenza = 100. Pretrattare un substrato di stampa al silicio (vedere Tabella dei materiali) utilizzando un processo di pulizia al plasma (gas: O2; potenza: 200 watt; temperatura: 25 °C; flusso: 20; tempo: 5 min), quindi immergere immediatamente il substrato in una soluzione di 30 ml di etanolo e 60 μl di 3-(trimetossisilil) metacrilato di propile in una capsula di Petri di vetro. Coprire con un foglio di alluminio e lasciare incubare durante la notte.NOTA: questo passaggio aumenta l’adesione della stampa al substrato, che è importante durante la separazione PDMS (passaggio 2.6). Caricare il file di stampa sulla stampante 3D multi-fotone, applicare la resina di stampa al substrato trattato, caricare la lente 10x (vedere Tabella dei materiali) e stampare le microstrutture. Una volta terminato, immergere la stampa in glicole propilenico metil etere acetato (vedi Tabella dei materiali) per 45 minuti per rimuovere il fotoresist non esposto, quindi immergere la stampa in alcool isopropilico per 5 minuti. Post-polimerizzare lo stampo principale esponendolo alla luce UV a 254 nm per 120 min.NOTA: Se disponibile, la luce UV nell’intervallo da 405 a 365 nm può essere utilizzata per ~ 20 minuti per post-polimerizzare le strutture stampate. 2. Generazione di stampi in polidimetilsilossano (PDMS) Trattare la superficie dello stampo principale stampato in 3D posizionandolo in una camera a vuoto contenente un vetrino con 40 μL di tricloro(1H,1H,2H,2H,-perfluoroottile) (vedi Tabella dei materiali) silano aggiunto alla superficie. Tirare il vuoto (pressione relativa: -20 in. Hg) per 1 h.NOTA: Questo passaggio garantisce una facile separazione durante la sformatura (passaggio 2.6). Durante il trattamento della superficie dello stampo principale, miscelare accuratamente la base di prepolimero di polidimetilsilossano (PDMS) con l’agente polimerizzante prepolimerizzante PDMS in un rapporto di 9: 1 in massa (sono necessari almeno 10 g di materiale per ogni stampo principale). Una volta miscelato accuratamente, trasferire il PDMS non polimerizzato in una provetta da centrifuga da 50 ml e centrifugare a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Una volta completato il trattamento superficiale, posizionare lo stampo principale in un piatto di alluminio e versare il PDMS non polimerizzato sopra lo stampo, assicurandosi che le caratteristiche siano completamente sommerse. Posizionare la capsula di alluminio in una camera a vuoto e tirare il vuoto (pressione relativa: -20 in. Hg) per 1 ora per rimuovere le bolle d’aria. Rimuovere il piatto di alluminio dalla camera a vuoto. Posizionare distanziatori da 800 μm alle estremità dello stampo principale e sovrapporre un vetrino pulito sullo stampo principale, avendo cura di evitare l’introduzione di bolle d’aria. Utilizzare clip leganti per bloccare lo stampo e la slitta insieme, localizzando la forza di serraggio sui distanziatori (Figura supplementare 2). Posizionare la struttura in un forno impostato a 120 °C per almeno 4 ore per polimerizzare il prepolimero in stampi PDMS. Rimuovere la struttura dal forno, rilasciare con cura le clip leganti e separare accuratamente lo stampo principale dallo stampo PDMS polimerizzato utilizzando una lama di rasoio.NOTA: lo stampo principale stampato in 3D può essere riutilizzato per generare stampi PDMS aggiuntivi. 3. Fabbricazione di film PLGA Pesare 450 mg di PLGA (vedi Tabella dei materiali) e posizionarlo su un foglio di polimero antiaderente di 76 mm per 76 mm all’interno di uno spessore ad anello di 250 μm, con un diametro interno di 50,8 mm. Posizionare un secondo foglio di polimero antiaderente sul PLGA e comprimere la pila tra due blocchi di alluminio utilizzando un morsetto a C da 101,6 mm fino a quando non è a tenuta di dito.NOTA: 502H PLGA è stato utilizzato esclusivamente in questo studio; tuttavia, altri tipi di PLGA sono compatibili con questo processo. Posizionare il gruppo bloccato a C in un forno sottovuoto impostato a 120 °C per 30 minuti sotto vuoto, con una pressione relativa di -30 in.Hg. Quindi, rimuovere il gruppo e stringere saldamente il morsetto prima di rimetterlo nel forno sottovuoto per altri 30 minuti.NOTA: Lo scopo principale dell’utilizzo di un vuoto è quello di evitare la degradazione del PLGA, che viene accelerata ad alte temperature. Togliere il gruppo dal forno e lasciarlo raffreddare per 4 ore in un essiccatore. Una volta raffreddato, allentare il morsetto, rimuovere la pellicola PLGA dai fogli polimerici antiaderenti e posizionare il film in una capsula di Petri etichettata. Conservare la capsula di Petri all’interno di un essiccatore per un uso successivo. 4. Generazione di particelle PLGA Trattare la superficie dello stampo PDMS come descritto in precedenza nel passaggio 2.1. Utilizzando una pinzetta e/o un bisturi, ritagliare e posizionare una porzione del film PLGA da 250 μm, all’incirca delle dimensioni dell’array, sullo stampo PDMS trattato. Sovrapporre un vetrino pulito al microscopio sulla parte superiore del film PLGA e dello stampo PDMS e bloccare i componenti insieme posizionando un morsetto a molla direttamente sull’array e sul film PLGA. Posizionare il gruppo stampo bloccato nel forno a vuoto impostato su 120 °C e tirare il vuoto con una pressione relativa di -30 pollici. Hg per 1 h.NOTA: Il tempo necessario per formare le particelle dipende dal PLGA e può variare da 1 a 12 ore. Rimuovere il gruppo stampo bloccato dal forno e lasciarlo raffreddare passivamente a temperatura ambiente per circa 15 minuti, o fino a quando non si raffredda al tatto. Utilizzando una lametta da barba, applicare delicatamente una pressione tra lo stampo PDMS e l’array di particelle PLGA per separare i due. Conservare le particelle PLGA in un essiccatore per un uso futuro. 5. Concentrazione e purificazione dell’antigene Scongelare un’aliquota dell’antigene RABV disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente. Assemblare la configurazione di filtrazione posizionando due filtri centrifughi con un limite di peso molecolare di 100 kDa (MWCO; vedere la tabella dei materiali) in due tubi di raccolta. Prebagnare i due filtri centrifughi aggiungendo 500 μL di acqua UltraPura. Centrifugare i filtri a 2.400 x g per 1 minuto in una centrifuga da banco a temperatura ambiente. Rimuovere l’acqua dai compartimenti superiore e inferiore della configurazione di filtrazione utilizzando una pipetta da 200 μL.NOTA: Non lasciare asciugare il filtro di rotazione prebagnato. Aggiungere 400 μL di acqua distillata nello scomparto superiore di ciascun filtro di spin, quindi aggiungere 100 μL dell’antigene RABV scongelato e mescolare con la pipetta.NOTA: Questo studio ha concentrato l’antigene di circa cinque volte e ha ridotto la concentrazione di eccipienti <100 kDa di ~ 50 volte. Caricare i due filtri centrifughi centrifughi in una centrifuga da banco, assicurandosi che i filtri siano rivolti verso il centro della centrifuga. Segnare quale lato del filtro è rivolto verso il centro della centrifuga.NOTA: se orientate in modo errato, le soluzioni non saranno adeguatamente filtrate/concentrate. Centrifugare i filtri a 14.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Recuperare i filtri dalla centrifuga. Le provette di raccolta conterranno il filtrato, mentre i filtri conterranno il campione concentrato (Figura supplementare 3A). Rimuovere il filtrato nelle provette di raccolta utilizzando una pipetta e gettarlo. Aggiungere 450 μL di acqua distillata filtrata a ciascun filtro e mescolare il campione concentrato e l’acqua mediante pipettaggio su e giù sei volte. Centrifugare i due filtri spin una seconda volta a 14.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che i filtri siano rivolti verso il centro della centrifuga con lo stesso orientamento del punto 5.7. Prelevare le unità filtranti dalla centrifuga e, come prima, rimuovere ed eliminare il filtrato da ciascun tubo utilizzando una pipetta. Rimuovere i filtri di centrifuga dai tubi di raccolta e tappare gli involucri filtranti utilizzando la parte superiore dei tubi di raccolta (figura supplementare 3B). Posizionare la parte inferiore degli involucri del filtro di spin direttamente su un vortice e un vortice a 3.000 giri/min per 30 s, tenendo gli involucri del filtro in posizione verticale e ad angoli di 45° (Figura supplementare 3C).NOTA: Questo passaggio ha lo scopo di risospendere qualsiasi antigene RABV che ha formato un pellet durante il processo di centrifugazione. Rimuovere con cautela il tappo dei tubi di raccolta dagli involucri del filtro di rotazione. Riposizionare gli involucri filtranti nei tubi di raccolta forniti ed eseguire una rotazione rapida (2-3 s) per raccogliere qualsiasi volume che potrebbe essere rimasto intrappolato nel tappo.NOTA: Questa centrifuga rapida deve essere eseguita in una microcentrifuga da banco. I filtri devono essere tangenziali alla centrifuga, opposti alla configurazione precedente, per garantire che nessuna soluzione venga persa attraverso i filtri. Capovolgere ogni unità filtrante di centrifuga in un nuovo tubo di raccolta fornito con il kit di filtro di rotazione (vedere la tabella dei materiali) e centrifugare per 2 minuti a 1.000 x g a temperatura ambiente per raccogliere i campioni concentrati. Consolidare i campioni concentrati dalle due provette di raccolta in un’unica provetta di raccolta. Misurare e registrare il volume risultante.NOTA: Il campione risultante avrà 5 volte la concentrazione iniziale di antigene come lo stock, avrà una piccola concentrazione di eccipiente (<100 kDa) circa 50 volte inferiore rispetto allo stock e apparirà leggermente bianco latte. Il volume totale dovrebbe essere di circa 44-48 μL. Conservare l’antigene concentrato 5x lavato due volte a 4 °C fino al momento dell’erogazione, ma per non più di 16 ore. Prima di riempire le particelle con questa soluzione, centrifugare il tubo a 1.000 x g per 1 minuto per rimuovere eventuali bolle. La soluzione può essere diluita utilizzando acqua distillata per raggiungere la concentrazione nominale target per l’erogazione. 6. Riempimento di particelle Filtrare sottovuoto 500 ml di acqua deionizzata attraverso un filtro a vuoto da 0,22 μm, quindi degasare la soluzione applicando un vuoto (pressione relativa: -20 in. Hg) sotto sonicazione per 20 min. Durante questo periodo, collegare i capillari piezoelettrici (PDC; vedere la tabella dei materiali) al distributore piezoelettrico. Innescare la macchina secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali) e posizionare la slitta con le particelle PLGA nell’area di erogazione. Impostare “Trova punti di riferimento di destinazione”, eseguire, quindi impostare il “Substrato di destinazione”, in base alla Figura supplementare 4. Caricare 25 μL dell’antigene concentrato nella piastra sorgente e caricarlo nella macchina. Utilizzando i PDC, aspirare 10 μL di antigene concentrato nella punta di erogazione, lavare l’esterno della punta, quindi calibrare l’allineamento di erogazione (Figura supplementare 5). Immettere “Parametri di configurazione di destinazione” e fare clic su Esegui (Figura supplementare 6). Una volta completato, rimuovere le particelle riempite e verificare che siano riempite sotto uno stereoscopio. Passare direttamente al passaggio successivo del protocollo. 7. Sigillatura e raccolta delle particelle Posizionare un blocco di acciaio inossidabile (vedere la tabella dei materiali) su una piastra elettrica. Posizionare due vetrini da microscopio sul blocco di acciaio inossidabile in modo che siano paralleli. Assicurarsi che il blocco in acciaio inossidabile sia in piano, quindi accendere la piastra riscaldante e impostare la temperatura in modo che la temperatura superficiale dell’acciaio inossidabile sia di 200 °C. Verificare la temperatura della piastra riscaldante prima della sigillatura. Sospendere le particelle di PLGA riempite sopra la piastra riscaldante posizionandole sui due vetrini, quindi avviare immediatamente un timer per 18 s.NOTA: La quantità di tempo e le particelle di calore necessarie per sigillare variano a seconda delle proprietà chimiche del PLGA utilizzato per produrre le particelle. Un supporto per vetrini stampato in 3D personalizzato può essere utilizzato per gestire le diapositive a una distanza di sicurezza dalla piastra elettrica. Il file STL viene fornito come file di codifica supplementare 2. Una volta sigillato, rimuovere l’array di particelle dalla piastra riscaldante e sospenderlo sopra il banco di laboratorio posizionando l’array di particelle su due vetrini separati. Lasciare raffreddare le particelle per 1 minuto. Una volta raffreddate, le particelle possono essere raccolte usando un bisturi mentre si guarda attraverso uno stereoscopio. Tenere il bisturi con la lama con un angolo di 45° rispetto al vetrino e applicare pressione alla base della particella per separarla dal vetrino. Una volta raccolto, utilizzare il bisturi per trasferire le particelle in provette leganti a basso contenuto proteico da 0,5 ml (vedere la tabella dei materiali). Quindi, riempire le provette con 250 μL di una soluzione tampone fosfato 1x (PBS) contenente 30 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) e 1 mg/ml di glucosio.NOTA: La soluzione di 30 mg/mL BSA e 1 mg/mL di glucosio preparata in PBS manterrà la stabilità dell’antigene RABV. Schiacciare le particelle sotto uno stereoscopio usando un paio di pinzette a punta fine. Assicurarsi che l’antigene RABV nel nucleo della particella sia disponibile per essere sciolto nella soluzione circostante. Conservare i campioni in frigorifero a 4 °C fino a quando la potenza dell’antigene può essere valutata utilizzando un test ELISA. I campioni devono essere eseguiti su un ELSIA entro 7 giorni dalla preparazione. 8. Valutazione dell’antigene mediante ELISA ATTENZIONE: Non lasciare asciugare le micropiastre in nessun punto. Impilare sempre i piatti e coprire sempre la piastra superiore con un sigillo di plastica, un piatto vuoto o un coperchio per evitare di asciugarsi. Preparare i buffer come indicato nel file supplementare 1. Preparare 5 mL di soluzione di rivestimento (tampone carbonato-bicarbonato, pH 9,6) ad una concentrazione di 2,5 μg/mL aggiungendo 25 μL dell’anticorpo di rivestimento a 4975 μL di tampone di rivestimento a pH 9,4-9,6.NOTA: sono necessari 5 ml per rivestire 96 pozzetti con 50 μL ciascuno (con volume extra per la perdita di pipettaggio). Aumentare il volume totale di 5 ml per ogni piastra ELISA aggiuntiva necessaria. Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 50 μL della soluzione di rivestimento in ciascun pozzetto della micropiastra. La soluzione deve essere utilizzata per il rivestimento immediatamente dopo la preparazione. Picchiettare delicatamente lungo i bordi della piastra su un palmo guantato per assicurarsi che il fondo di ciascun pozzetto sia uniformemente coperto di liquido. Sigillare la piastra con pellicola adesiva e posizionarla a 37 °C per 1 ora, quindi trasferire a 4 °C durante la notte. Prelevare le piastre dalla cella frigorifera e lavarle tre volte con 200 μL di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto. Rimuovere il tampone di lavaggio ed erogare 300 μL di tampone bloccante in ciascun pozzetto.ATTENZIONE: Quando si eseguono più piastre con gli stessi campioni ripetuti su piastre diverse, è importante procedere piastra per piastra (ad esempio, riempire la piastra 1 con il materiale prima di procedere alla piastra 2, quindi alla piastra 3 e così via). Non applicare il materiale X a tutte le piastre e poi al materiale Y, ecc., poiché ciò aumenterebbe il rischio di essiccazione dei pozzi. Dopo la fase finale di lavaggio, il tampone di lavaggio deve rimanere nei pozzetti della piastra e deve essere eliminato solo immediatamente prima di aggiungere campioni alla piastra. Un coperchio di plastica a 96 pozzetti deve essere utilizzato per coprire tutti i pozzetti della piastra ELISA che non vengono erogati immediatamente e il coperchio spostato in sequenza per rivelare ulteriori pozzi da riempire con materiale. Sigillare le lastre con una pellicola di plastica adesiva (vedi Tabella dei materiali) e metterle in un’incubatrice per 60 ± 5 minuti a 37 ± 2 °C. Preparare la curva standard e i campioni di prova da valutare durante questa incubazione.NOTA: L’antigene da valutare deve essere prediluito in tampone diluente ad una diluizione raccomandata di 0,125 UI/ml, con un volume in eccesso di almeno 40 μL per tenere conto della perdita di pipettaggio. Tutti i campioni sono valutati in duplice copia (due repliche tecniche) su ogni piastra ELISA. Per la curva standard, una serie di diluizione doppia per un totale di otto punti deve essere inclusa nelle colonne 2 e 3 di ciascuna piastra ELISA. Una serie di diluizioni può essere eseguita per tutti gli altri campioni con un numero appropriato di punti in base alla quantità prevista di antigene da valutare. Sebbene meno rigorosa per una maggiore produttività, una singola diluizione del campione può essere utilizzata come alternativa alla placcatura sopra descritta. Tuttavia, la concentrazione attesa di una singola diluizione deve rientrare nell’intervallo di curvatura standard. Nelle piastre a 96 pozzetti proteici a basso legame o nei tubi proteici a basso legame (vedere la tabella dei materiali), eseguire una doppia serie di diluizioni di ciascun campione lungo le colonne della piastra. Caricare l’inizio della serie di diluizione nella riga A per ciascun campione al doppio del volume finale richiesto (per piastra sono necessari 100 μL di campione per pozzetto, quindi tutti i pozzetti in A2-A11 devono contenere almeno 240 μL di un campione, con un volume aggiuntivo di 40 μL per tenere conto della perdita di pipettaggio). Caricare 120 μL di tampone diluente in tutti gli altri pozzetti sulla piastra proteica a basso legame, escluse le colonne 1 e 12 (cioè da B2 a H11). Utilizzando una pipetta multicanale caricata con 10 punte, eseguire la diluizione seriale trasferendo 120 μL di campione da A2-A11 a B2-B11 e pipettare su e giù più volte per miscelare evitando schizzi e bolle. Ripetere questo processo, spostandosi lungo la piastra lungo le colonne fino ai pozzetti H2-H11. Eliminare il restante volume da 120 μL aspirato dall’ultima fila di pozzi.NOTA: i campioni sono ora pronti per l’analisi. Se la fase di blocco non è completata entro questo momento, assicurarsi che i campioni siano conservati sul ghiaccio. Al termine della fase di incubazione, lavare le piastre tre volte con 200 μL di tampone di lavaggio. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 μL di tampone diluente nelle colonne 1 e 12 come “spazi vuoti”. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 μL da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti proteici a basso legame contenente diluizioni del campione alla piastra ELISA lavata. Ripetere l’operazione per tutte le piastre ELISA in esecuzione. Sigillare le piastre con una pellicola di plastica adesiva e metterle in un’incubatrice per 60 ± 5 minuti a 37 ± 2 °C. Preparare la soluzione anticorpale di rilevazione (vedere Tabella dei materiali) ad una concentrazione di 0,2 μg/mL aggiungendo 4,4 μL della soluzione anticorpale a 10.995,6 μL del tampone diluente e mescolare bene pipettando su e giù.NOTA: è necessario un totale di 11 ml per 96 pozzetti a 100 μL ciascuno (con volume aggiuntivo per le perdite di pipettaggio). Aumentare il volume totale di 11 ml per ogni piastra ELISA aggiuntiva da valutare. La soluzione deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione. Al termine della fase di incubazione, lavare le piastre cinque volte con 200 μL di tampone di lavaggio. Aspirare il tampone di lavaggio rimanente ed erogare 100 μL della soluzione anticorpale di rilevazione in ciascun pozzetto sulla micropiastra utilizzando una pipetta multicanale. Sigillare le piastre con una pellicola di plastica adesiva e metterle in un’incubatrice per 60 ± 5 minuti a 37 ± 2 °C. Preparare il coniugato verso la fine della fase di incubazione degli anticorpi di rilevazione aggiungendo 4,4 μL di soluzione coniugata streptavidina-perossidasi (vedere Tabella dei materiali) a 10.995,6 μL di tampone di lavaggio.NOTA: sono necessari un totale di 11 ml per 96 pozzetti a 100 μL ciascuno (con volume aggiuntivo per il pipettaggio multicanale). Aumentare il volume totale di 11 ml per ogni piastra ELISA aggiuntiva da valutare. Lavare le piastre cinque volte con 200 μL di tampone di lavaggio. Aspirare il tampone di lavaggio rimanente ed erogare 100 μL della soluzione coniugata a ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con un film plastico adesivo e metterle in un incubatore a 37 °C per 60 ± 5 minuti a 37 ± 2 °C. Preparare il substrato durante la fase finale di lavaggio secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Per ogni piastra, sciogliere una compressa di o-fenilendiammina dicloridrato (OPD; vedere Tabella dei materiali) in 9 ml di acqua deionizzata al buio, quindi rabboccare con 1 mL di tampone perossido stabile 10x. Regolare il numero di compresse e il volume totale della soluzione (10 ml) in base al numero di piastre da valutare. Lavare le piastre cinque volte con 200 μL di tampone di lavaggio. Erogare 100 μL del substrato a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Sigillare le piastre con un film plastico adesivo e lasciarle sul banco per 10-20 minuti, al riparo dalla luce, utilizzando un foglio di alluminio.NOTA: monitorare visivamente lo sviluppo del colore per evitare la saturazione. Aggiungere immediatamente 50 μL di soluzione di arresto a ciascun pozzetto e alla piastra di lettura per un’assorbanza a 492 nm e un’assorbanza di riferimento di 620 nm. Analizzare i dati utilizzando la lettura di assorbanza corretta (lettura a 492 nm meno la lettura a 620 nm) e sottrarre la media del bianco da tutti i campioni. Utilizzare un metodo di interpolazione sigmoidale 4PL per convertire i valori di assorbanza in UI/mL. Infine, moltiplicare per 250 μL (volume totale del campione) per convertire in UI.NOTA: questa analisi può essere eseguita utilizzando il software di analisi dei dati.

Representative Results

La sigillatura e il riempimento delle particelle sono due dei passaggi più critici di questo protocollo. Le particelle sono state riempite con sale sodico di fluoresceina per dimostrare il riempimento ideale e alcuni errori comuni. Il sale sodico di fluoresceina è stato utilizzato al posto dell’antigene RABV per facilitare la visualizzazione. Durante il riempimento, è importante erogare la soluzione sul fondo dei nuclei di particelle, quindi attendere il tempo sufficiente per l’evaporazione del solvente / acqua. Una volta completato, un deposito del soluto rimane sul fondo del nucleo della particella (Figura 1A). Una volta riempito, è fondamentale sigillare correttamente le particelle. La Figura 1B illustra diversi risultati (positivi e negativi) del processo di sigillatura. Dopo 12 secondi di tempo di sigillatura, rimane un percorso distinto dal centro della particella all’esterno della particella, dimostrando una particella che non è completamente sigillata. Al contrario, se lasciato sigillare per 36 s, il PLGA fonde quasi interamente, risultando in una microstruttura con un profilo poco profondo. La morfologia ideale può essere visualizzata quando le particelle sono sigillate per 18 e 24 s, poiché contengono carichi interamente incapsulati dal polimero mantenendo una struttura particellare. La Figura 1C mostra diversi potenziali risultati dopo il riempimento e la sigillatura. Durante l’erogazione, se il solvente non raggiunge il fondo delle particelle, lascia il soluto essiccato nel mezzo del nucleo della particella (riempito in modo errato); Sebbene queste particelle possano ancora sigillarsi, lo scarso carico del carico può limitare l’efficienza di carico. Se le particelle vengono riempite con troppo carico (riempito in eccesso), il processo di sigillatura viene inibito, poiché il carico impedisce al PLGA di fluire sull’apertura. Se correttamente riempite e sigillate, le particelle di questa geometria sono abbastanza piccole da adattarsi facilmente all’interno di un ago da 19 G. Inoltre, 10 particelle fluivano costantemente attraverso un ago da 19 G (100% ± 0%) quando iniettate con una soluzione viscosa come carbossimetilcellulosa al 2% (Figura 7 supplementare). Figura 1: Problemi comuni con il processo di riempimento e sigillatura . (A) Le immagini mostrano l’evaporazione del solvente dopo un ciclo di riempimento, dove le particelle vengono caricate con 6 nL di 100 mg/mL di sale sodico di fluoresceina disciolto in acqua. (B) Immagini rappresentative di particelle PLGA 502H rimosse dal processo di sigillatura a 0, 12, 18, 24 e 36 s. (C) Risultati diversi del processo di sigillatura quando le particelle sono riempite correttamente, in modo errato o riempite in eccesso. Le immagini vengono generate impilando più immagini e unendole utilizzando il software di messa a fuoco. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. L’elaborazione dell’antigene attraverso un filtro di spin prima di caricarlo nelle particelle è importante per due motivi. In primo luogo, la centrifugazione serve a rimuovere gli eccipienti stock nella soluzione vaccinale, che possono limitare la capacità di carico delle particelle mantenendo l’antigene RABV. L’attuale protocollo purifica l’antigene di circa 50 volte. In secondo luogo, anche l’antigene è concentrato durante questo processo. La Figura 2A mostra una micrografia dei virioni RABV intatti nel campione di antigene concentrato. Questo antigene è circa 4,4 volte più concentrato della soluzione madre iniziale (Figura 2B). La quantità di antigene inizialmente caricata nei filtri centrifughi può essere modificata per modulare la concentrazione finale di piega raggiunta. Ad esempio, il caricamento di 40 μL di antigene madre si traduce in una concentrazione approssimativa di 1,75 volte. La figura supplementare 8 dimostra l’importanza del vortice (fase 5.15) nel processo di concentrazione. Trascurare il vortice o vortice improprio i campioni limita il processo di concentrazione. Figura 2: Concentrazione dell’antigene. La concentrazione di antigene mediante filtrazione centrifuga mostrata mediante microscopia elettronica a trasmissione (A) e confermata da ELISA (B). Le barre di errore indicano la deviazione standard. L’analisi statistica viene eseguita utilizzando i test di confronto multipli di Tukey con ANOVA unidirezionale. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. La figura 3A mostra l’antigene concentrato riempito in particelle non sigillate e sigillate. Sebbene una quantità significativa di antigene venga caricata nelle particelle (0,0469 ± 0,0086 UI), questo materiale comprende il <90% della capacità delle particelle, lasciando ampio spazio per il caricamento di antigene aggiuntivo. È interessante notare che le particelle non sigillate contengono solo 0,0396 ± 0,0077 UI, comprendendo solo l'85% ± il 16% della quantità totale caricata. Sebbene si tratti di una perdita statisticamente insignificante, parte dell'antigene RABV potrebbe essersi denaturato durante ripetute reidratazioni e asciugature nel processo di riempimento. Dopo la sigillatura, il 69% ± il 5% dell'antigene rimane incapsulato in forma bioattiva. Sebbene ciò suggerisca che si verifichi una perdita significativa durante il processo di sigillatura a causa dello stress termico, la maggior parte dell'antigene virale inattivato rimane intatto (Figura 3B). La co-incapsulazione degli eccipienti stabilizzanti insieme all’antigene è una possibile strategia per aumentare ulteriormente la stabilità dell’antigene durante tutto il processo di fabbricazione, e in precedenza ha avuto successo con altri antigeni virali inattivati14,15. Figura 3: Antigene RABV bioattivo dopo fabbricazione di particelle . (A) Le immagini mostrano particelle non sigillate e sigillate contenenti l’antigene RABV. (B) Stabilità dell’antigene attraverso il processo di fabbricazione delle particelle (n = 4). Il controllo del carico viene generato erogando l’antigene direttamente nella soluzione. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Barra di scala = 200 μm. L’analisi statistica viene eseguita utilizzando i test di confronto multipli di Tukey con ANOVA unidirezionale. *p < 0,05. Le immagini vengono generate impilando più immagini e unendole utilizzando il software di messa a fuoco. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura supplementare 1: Dimensioni delle particelle, fiduciali e dell’array. La figura mostra le proprietà geometriche della stella fiduciale a quattro punte (A), della microparticella cilindrica (B), della stella fiduciale a cinque punte (C) e di una serie di particelle con fiduciali (D) visualizzate nel software CAD. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 2: Questa figura mostra una sezione trasversale della struttura posta nel forno per polimerizzare gli stampi PDMS. Le frecce indicano dove vengono applicati i morsetti del legante. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 3: Tecnica corretta per recuperare efficacemente l’antigene concentrato. Alla fine del primo giro, il campione concentrato cerchiato in rosso (A) viene trattenuto nel filtro, mentre il filtrato viene raccolto nella parte inferiore del tubo di raccolta (tubo esterno più grande). Per risospendere l’antigene pellettato, l’unità filtrante centrifuga viene coperta utilizzando il tubo di raccolta (B) in preparazione al vortice. Durante il vortice, la punta del tubo viene mantenuta in contatto con il cuscinetto del vortice e l’estremità del cappuccio ruotata mantenendo un angolo di 45° con il pad del vortice (C). Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 4: Distributore piezoelettrico di programmazione pre-esecuzione. (A) Impostare “Trova punti di riferimento target” navigando dalla “scheda principale” alla funzione Configurazione robot > varie >Div. > Trova punti di riferimento target. Utilizzare i pulsanti evidenziati in blu per impostare i marchi fiduciari. Innanzitutto, seleziona Impara modello e disegna una casella attorno al marchio fiduciario di interesse, verifica l’accuratezza del modello facendo clic su Cerca modello e salva il modello. Eseguire questa operazione per le stelle a quattro e cinque punte e salvare i nomi dei file in base alle istruzioni riportate in Usa due immagini modello diverse. Quindi, assicurati che tutti i parametri nelle caselle nere corrispondano. Caricare la stella fiduciale a quattro punte utilizzando il modello di caricamento (riquadro verde). Salvare il programma “Trova punti di riferimento target” selezionando Elenco attività (casella arancione). (B) Impostare Esegui accedendo alla scheda Configurazione robot > attività, quindi caricare la sequenza di attività mostrata nella casella blu aggiungendo attività dall’Elenco attività (casella nera) utilizzando le selezioni Attività in Esegui (casella verde). Infine, salva l’attività (casella arancione). (C) Impostare il “Substrato di destinazione” accedendo alla configurazione del robot > al substrato di destinazione, quindi aggiungere un bersaglio (riquadro blu). (D) Immettere i parametri mostrati qui e selezionare Salva (riquadro blu). Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 5: Caricamento dell’antigene e calibrazione dell’allineamento della spesa. (A) Accedere alla scheda Nozzle Setup > Do Task e aspirare 10 μL dell’antigene nella punta di erogazione selezionando TakeProbe10 uL (scatola nera) e facendo clic su DO (scatola nera). (B) Si apre una finestra separata. Selezionare il pozzetto in cui è stato caricato l’antigene concentrato e selezionare OK (riquadro blu). (C) Dopo che l’antigene è stato aspirato, lavare la punta selezionando la scatola blu e ripetere il lavaggio altre due volte. Selezionare la fotocamera (scatola nera) e determinare il volume di rilascio selezionando il volume di rilascio (riquadro verde). Assicurarsi che si stia formando una goccia stabile con una deviazione standard del volume (%) <2 (riquadro arancione). (D) Seguendo questi passaggi si aprirà la Snap Drop Cam; selezionare Immagine (riquadro blu) nel menu a discesa e selezionare Nozzle Head Camera Wizard. Si apre una nuova finestra. Esegui rapidamente la sequenza successiva di passaggi. (E) Assicurarsi che la destinazione indicata nella Figura 4 supplementare sia caricata, quindi selezionare Sposta su destinazione (riquadro blu). Regola le gocce su 15 e seleziona Spot (scatola nera). Una volta individuato, seleziona immediatamente Sposta (casella verde). Assicurati che la ricerca automatica sia selezionata ed elimina la dimensione delle particelle = 12, quindi fai clic su Start (caselle arancioni). Se il rilevamento automatico non riesce, ripetere questa procedura dopo essersi spostati in un’area diversa della diapositiva (riquadro viola). Clicca qui per scaricare questo file. Figura 6 supplementare: Programmazione dell’array di individuazione e inizio dell’esecuzione. (A) Passare alla configurazione di destinazione > destinazione, quindi compilare i parametri mostrati nella casella blu. (B) Quindi, vai alla scheda “Impostazione campo” e inserisci 20 nel no. del campo gocce (casella blu), selezionare un pozzetto (scatola nera), quindi selezionare i bersagli / particelle in cui erogare (casella verde). Selezionando un pozzetto diverso e riselezionando i bersagli/particelle, vengono eseguiti cicli di riempimento aggiuntivi durante una singola corsa. (C) Nella schermata principale, assicurarsi che la corsa e la destinazione create nella Figura 5 supplementare siano selezionate. (D) Vai alla scheda “Esegui” e seleziona Avvia esecuzione (casella blu). Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 7: Iniettabilità di microparticelle. (A-C) Immagini stereoscopiche di microparticelle riempite di sale sodico di fluoresceina e sigillate in un ago da 19 G. (D) Un totale di 10 particelle sono state iniettate attraverso un ago da 19 G utilizzando una soluzione di carbossimetilcellulosa al 2% (n = 8). Barra di scala = 1 mm. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 8: Potenziali problemi con la concentrazione dell’antigene. La linea rossa indica l’aumento atteso della concentrazione. Le barre di errore indicano una deviazione standard. L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando i test di confronto multipli di Tukey con ANOVA unidirezionale. p < 0,001, ****p < 0,0001. Clicca qui per scaricare questo file. File supplementare 1: Preparazione di tamponi e soluzioni per RABV ELISA. Clicca qui per scaricare questo file. Supplementary Coding File 1: file STL contenente array di particelle. Clicca qui per scaricare questo file. Supplementary Coding File 2: file STL contenente la geometria per il portavetrini personalizzato utilizzato per sigillare le particelle. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

È possibile modificare la geometria delle particelle per esigenze specifiche; Tuttavia, per le strutture cilindriche, gli autori raccomandano di mantenere un rapporto 5: 4: 1 dell’altezza:diametro:spessore della parete descritto nel protocollo. Questo rapporto di aspetto garantisce la presenza di materiale PLGA sufficiente per sigillare le particelle e rimanere meccanicamente abbastanza robusto per la movimentazione. Le dimensioni e le forme delle particelle possono essere facilmente modificate durante il processo CAD, consentendo di generare una miriade di geometrie. La combinazione della flessibilità del CAD con la stampa 3D consente la rapida iterazione dei progetti di microparticelle. Sebbene questo protocollo utilizzi una stampante 3D multi-fotone, qualsiasi stampante 3D con specifiche in grado di stampare le dimensioni della microstruttura in un materiale appropriato può essere utilizzata per generare lo stampo principale iniziale. Inoltre, la fotolitografia è stata precedentemente utilizzata per realizzare strutture simili in matrici molto più grandi di quelle prodotte in questo protocollo; Tuttavia, il lavoro, il ritardo nell’ordinare maschere fotografiche su misura e l’accessibilità delle apparecchiature rallenterebbero il processo di progettazione iterativo16. Infine, la generazione di stampi master può essere esternalizzata a società di servizi a pagamento se la fabbricazione interna di stampi master non è fattibile. Indipendentemente dalla stampante 3D o dal metodo utilizzato per generare gli stampi master, l’adesione della stampa al substrato è fondamentale per le fasi a valle. In particolare, se l’adesione è inadeguata durante la generazione dello stampo PDMS, le particelle stampate rimarranno depositate nello stampo PDMS, richiedendo la rimozione manuale delle particelle stampate e la distruzione dello stampo principale.

Il riempimento di particelle è un altro aspetto critico da considerare. Le microparticelle hanno capacità di riempimento limitate, quindi la filtrazione viene utilizzata non solo per concentrare l’antigene RABV, ma anche per rimuovere gli eccipienti che altrimenti occuperebbero gran parte del volume del nucleo delle microparticelle. Tuttavia, date le grandi dimensioni dell’antigene RABV (circa 60 nm per 180 nm)17, è possibile pellettare parzialmente l’antigene durante le fasi di centrifugazione. Per questo motivo, è importante risospendere l’antigene mediante pipettaggio o vortice dopo centrifugazione per ottenere un elevato recupero dell’antigene RABV. Una soluzione altamente concentrata è ideale per l’erogazione, perché riduce i cicli di erogazione e quindi limita la degradazione dell’antigene durante il riempimento. Tuttavia, la viscosità è una delle principali limitazioni dei robot di erogazione piezoelettrici che formano una caduta stabile, quindi l’erogazione di una soluzione ad altissima concentrazione potrebbe non essere possibile o consigliabile. Diluire la soluzione di riempimento è il modo più semplice per ottenere una formazione stabile di gocce, ma è necessario considerare la stabilità dell’antigene nei cicli di riempimento aggiuntivi necessari per ottenere il carico desiderato e la maggiore quantità di tempo necessaria per riempire le particelle.

Limitazioni
Questo metodo richiede attrezzature altamente specializzate per produrre gli stampi iniziali e uno strumento di riempimento specializzato per la produzione di microparticelle. Sebbene la necessità di una stampante 3D con una risoluzione di stampa in grado di generare gli stampi master iniziali possa essere sovvertita da un approccio a pagamento, l’accessibilità a un robot di erogazione piezoelettrico è limitante. L’acquisto di un robot di erogazione piezoelettrico richiede un significativo investimento iniziale iniziale, spesso compreso tra $ 80.000 e $ 200.000, a seconda della marca, della produttività e delle capacità. Sebbene molti altri metodi di riempimento siano potenziali alternative, questi metodi non sono stati convalidati utilizzando l’antigene RABV12.

Applicazioni future
Una percentuale sostanziale dell’antigene RABV incapsulato è rimasta stabile durante il processo di sigillatura. In teoria, incorporando questo antigene in particelle composte da diversi tipi di PLGA che imitano la tempistica di somministrazione del trattamento di profilassi post-esposizione, tutte le dosi potrebbero essere somministrate in una singola iniezione. Eliminare la necessità di ripetere le visite ospedaliere per somministrare dosi aggiuntive migliorerà la compliance del paziente, con conseguenti migliori risultati del trattamento. Inoltre, avendo dimostrato la capacità di mantenere la reattività ELISA del virus della rabbia inattivato altamente complesso, è probabile che altri antigeni, compresi i vaccini a subunità, sarebbero compatibili con questo metodo di incapsulamento. L’uso di altri antigeni profilattici con microparticelle PULSATE potrebbe salvare milioni di vite nei LMIC aumentando i tassi di vaccinazione delle popolazioni sotto-vaccinate. Per raggiungere questo obiettivo, tuttavia, i vaccini devono rimanere stabili non solo attraverso l’incapsulamento ma anche il rilascio, che può essere difficile poiché il carico utile sarà soggetto a temperature elevate e a un microambiente potenzialmente acido a causa del calore corporeo e dei prodotti di degradazione del PLGA18. Il lavoro futuro perseguirà strategie di stabilizzazione dell’antigene attraverso il rilascio, che aprirebbero il potenziale per una piattaforma di vaccinazione a iniezione singola che è ampiamente applicabile per prevenire molte malattie infettive.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Chiron Behring e Bharat Biotech International per aver fornito a Particles for Humanity l’antigene RABV. Vorremmo anche ringraziare Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD., per la sua preziosa guida e contributi tecnici. Gli autori desiderano ringraziare la generosità della dottoressa Rebecca Richards-Kortum per aver permesso l’uso del suo apparecchio di erogazione picoliter SciFLEXARRAYER S3 e le istruzioni del Dr. Chelsey Smith sull’uso del dispositivo. Riconosciamo anche la Chan Medical School dell’Università del Massachusetts per aver generato immagini al microscopio dell’antigene della rabbia. Infine, ringraziamo Don Chickering e Erin Euliano per aver esaminato il documento prima della presentazione. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione (INV-004360) della Bill and Melinda Gates Foundation.

Materials

0.22 µm PES filter Cole-Parmer+B4B2:B63 04396-26
0.25 mm Shims McMaster Carr 98090A935
0.75 inch Binder Clips Staples 480114
10 mL Syringe Becton, Dickinson and Company 309604
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11E
101.6 mm C-Clamp Amazon PT-SD-CP01A Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens.
19 G needle EXCELINT 26438
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate  Millipore Sigma M6514-25ML
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Eppendorf 22431081
50 mL Centrifuge Tubes Corning  352098
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11F
Acetone Fisher AC268310010
Aluminum Block McMaster Carr 9057K175
Aluminum Foil VWR 89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa Millipore Sigma C82301
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 Fisherbrand 13-678-11D
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated Fisherbrand 14-388-100
Carboxymethyl Cellulose Tokyo Chemical Industries C0045
ClipTip 300, Filter, Racked Fisherbrand 13-678-11
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3206
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3207
Describe Nanoscribe Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2.
Software provided with the printer.
Desiccator Fisher Scientific 10529901 Or equivalent
Double-Sided Tape Staples 649280
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium Gibco 14200075
Ethanol VWR 89370-084
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL Fisherbrand 13-678-11E
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL Fisherbrand 13-678-11F
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL Fisherbrand 03-448-17
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL Fisherbrand FB14955202
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL Fisherbrand 13-374-10
Fisherbrand Elite Pipette Kit Fisherbrand 05-408-137
Fisherbrand Pipet Controller  Fisherbrand FB14955202
Glass Petri Dish, 90 mm VWR 470313-346
Glass Slides Globe Scientific 1380-10
Helicon Focus 8 HeliconSoft Software used to focus stack images
IP-Q Resin Nanoscribe Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple Amazon 5053485896236 Or equivalent
Microscope Slide Box Millipore Sigma Z374385-1EA Or equivalent
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective Nanoscribe
NanoWrite Nanoscribe Software used to interface with nanoscrive 3D printer.
Software provided with printer.
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate Invitrogen 44-2404-21
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) Fisherbrand 02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. Fisherbrand 13-374-10
PDC 60 with Type 3 Coating Scienion P-2020
PDMS Particle Molds Rice University n/a N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array.
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) Fisherbrand 02-707-430
Plastic Cups Fisher Scientific S04170
PLGA Film, 502H Sigma 502H: 719897-1G
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate Millipore Sigma 484431
Rabies Antigen Chiron Behring and Bharat Biotech International Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company.
Razor Blades VWR 55411-050
Scalpel VWR 21899-530 and 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 Scienion Or equivalent
Sealing Tape for 96-Well Plates Thermo Scientific 15036
Silicon Wafer University Wafer 1025
Spring Clamps IRWIN VGP58100
Stainless Steel Block McMaster Carr 9083K12
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive Fisherbrand 02-707-404
Sylgard 184 DOW 2646340
Teflon Sheet McMaster Carr 9266K12 Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces.
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick McMaster Carr 9266K81
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane Sigma 448931-10G
Tweezers  Pixnor ESD-16
UltraPure Distilled Water Fisher Scientific 10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker UVP 95-0174-01 Or equivalent
Vacuum Desiccator Bel-Art F420100000 Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination.
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C VWR 97027-664 Or equivalent
Vacuum, CRVpro4  Welch 3041-01 Or equivalent
Wooden Tongue Depressors Electron Microscopy Sciences 72320
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References

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Graf, T. P., Kadasia, K., Melhorn, S., Kessler, E., Yang, H., Baryakova, T., Brady, S., McHugh, K. J. Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen. J. Vis. Exp. (195), e65147, doi:10.3791/65147 (2023).
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