Deze methode beschrijft de inkapseling van het rabiësantigeen in biologisch afbreekbare polymere microdeeltjes met structurele en materiaaleigenschappen die pulsatiele afgifte na een vooraf bepaalde vertraging mogelijk maken. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) beoordeling van het antigeen dat uit de deeltjeskern wordt gehaald, bevestigt de aanwezigheid van intact trimerisch rabiësvirus glycoproteïne door deeltjesfabricage.
De huidige richtlijnen voor rabiës na blootstelling profylaxe vereisen meerdere injecties toegediend over meerdere weken. Dit kan onevenredig belastend zijn voor mensen die in lage- en middeninkomenslanden (LMIC’s) wonen, waar de meerderheid van de dodelijke blootstellingen aan hondsdolheid voorkomt. Verschillende strategieën voor medicijnafgifte zijn onderzocht om vaccinregimes te condenseren tot een enkele injectie door antigenen in polymere deeltjes in te kapselen. Harde stressoren tijdens het inkapselingsproces kunnen echter denaturatie van het ingekapselde antigeen veroorzaken. Dit artikel beschrijft een methode voor het inkapselen van het rabiësvirus (RABV)-antigeen in polymere microdeeltjes die afstembare pulsatiele afgifte vertonen. Deze methode, genaamd Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED), genereert microdeeltjes met behulp van zachte lithografie om inverse polydimethylsiloxaan (PDMS) mallen te maken van een multi-foton, 3D-geprinte mastermal. Poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) films worden vervolgens compressiegegoten in de PDMS-mallen om cilinders met open gezicht te genereren die worden gevuld met geconcentreerde RABV met behulp van een piëzo-elektrische doseerrobot. Deze microstructuren worden vervolgens verzegeld door de bovenkant van de deeltjes te verwarmen, waardoor het materiaal kan stromen en een continue, niet-poreuze polymere barrière kan vormen. Postfabricage wordt een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) specifiek voor de detectie van intact trimerisch rabiësvirus glycoproteïne gebruikt om het hoge herstel van immunogeen antigeen uit de microdeeltjes te bevestigen.
Vaccinatie is een uiterst effectief hulpmiddel voor de gezondheidszorg, omdat het tussen 2000 en 2019 meer dan 37 miljoen sterfgevallen heeft voorkomen1. Ondanks deze effectiviteit blijven door vaccins te voorkomen ziekten een aanzienlijk risico vormen voor de wereldwijde gezondheid, vooral in lage- en middeninkomenslanden (LMIC’s) waar hoge percentages van niet- en ondervaccinatie bijdragen aan 1,5 miljoen door vaccins te voorkomen sterfgevallen per jaar2. Rabiës is geen uitzondering op deze verschillen. Ondanks zijn status als de meest dodelijke ziekte die de mensheid kent, bijna universeel dodelijk, is hondsdolheid volledig behandelbaar en wordt het geclassificeerd als uitgeroeid in veel landen met een hoog inkomen. In plaats daarvan wordt de last van hondsdolheid onevenredig gedragen door mensen die in delen van Azië en Afrika wonen, waar de ziekte verwoestende gevolgen heeft voor mens en vee 3,4.
Vaccinatie is van cruciaal belang voor het beheersen van de wereldwijde impact van hondsdolheid5. De kosten van vaccinatie verbieden wijdverspreide implementatie van pre-exposure profylaxe (PrEP), gezien de algehele lage incidentie van de ziekte. Bovendien wordt in LMIC’s het nut van profylaxe na blootstelling (PEP) beperkt door sociaaleconomische druk op patiënten die gezondheidszorg zoeken. Logistieke factoren, zoals reisafstand tot toegangspunten tot de gezondheidszorg, gederfde lonen tijdens het verkrijgen van een behandeling, de kosten van de behandeling, afspraken die de dagelijkse activiteiten verstoren en vergeetachtigheid, resulteren in PEP-nalevingspercentages zo laag als 60% 6,7. Dit hoge verloop van patiënten biedt een kans voor het verfijnen van benaderingen om hiaten in de vaccinatie tegen hondsdolheid aan te pakken om de ziekte te bestrijden.
Single-injection (SI) vaccinatiesystemen die de afgifte van antigenen regelen, zijn onderzocht als manieren om volledige immunisatie in één injectie te verkrijgen. Het elimineren van de noodzaak van meerdere bezoeken aan een zorgverlener vermindert de lasten die individuen ervan weerhouden adequate zorg te zoeken. Om SI-vaccinatie te bereiken, wordt een antigeen meestal ingekapseld in een biologisch afbreekbare polymere matrix die vaak de vorm aanneemt van injecteerbare microdeeltjes. Eenmaal geïnjecteerd, degradeert het polymeer en geeft het gesekwestreerde antigeen af. Tot op heden zijn twee primaire releasestrategieën gevolgd om SI-vaccinatie te bereiken. Bij één benadering wordt het antigeen gedurende een langere periode continu vrijgegeven. Hoewel bedoeld om de immunogeniciteit van een enkele injectie te verbeteren, is het onduidelijk of deze aanpak voldoende is om een beschermende immuunrespons tegen het rabiësvirus (RABV) bij mensen op te wekken8. In de andere wordt het antigeen vrijgegeven na een vooraf bepaalde vertraging om een conventioneel en bewezen prime-boost-vaccinregime na te bootsen. Sproeidrogen en op emulsie/solventverdamping gebaseerde microdeeltjesfabricagemethoden vertonen de eerste strategie en zijn gebruikt om zowel modelvaccins9 als zeer stabiele antigenen, zoals tetanustoxoïde10, met succes in te kapselen. Deze inkapselingsmethoden omvatten echter stressoren, waaronder warmte, oplosmiddelinteractie en fysieke krachten, die antigenen kunnen denatureren11.
Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED) is een recent ontwikkelde fabricagemethode die kan worden gebruikt om biologische geneesmiddelen in biologisch afbreekbare microdeeltjes in te kapselen. Micromolding wordt gebruikt om deeltjes te genereren die worden gevuld met een vloeibare lading en worden verwarmd om het polymeer opnieuw te laten stromen en het centrale depot van lading volledig in te kapselen in een aaneengesloten laag van het biologisch afbreekbare polymeer. Deze microstructuur resulteert in de pulsatiele afgifte van de lading, na een duur die afhankelijk is van de afbraaksnelheid van de polymere schil12. Dit manuscript toont de inkapseling van geïnactiveerde RABV in microdeeltjes bestaande uit poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA), een biologisch afbreekbaar polymeer dat wordt gebruikt in veel door de FDA goedgekeurde formuleringen13, met behulp van de PULSED-fabricagemethode om stabiel RABV-antigeen in te kapselen zoals geëvalueerd door een enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA). Door PLGA-deeltjes te combineren met verschillende molecuulgewichten en/of eindgroepen, heeft deze aanpak het potentieel om het huidige rabiësvaccinatietijdsverloop na een enkele injectie na te bootsen.
Het is mogelijk om de deeltjesgeometrie aan te passen aan specifieke behoeften; Voor cilindrische structuren raden de auteurs echter aan om een verhouding van 5: 4: 1 te handhaven van de hoogte : diameter : wanddikte beschreven in het protocol. Deze beeldverhouding zorgt ervoor dat er voldoende PLGA-materiaal aanwezig is om de deeltjes af te dichten en mechanisch robuust genoeg blijft voor hantering. Deeltjesafmetingen en -vormen kunnen eenvoudig worden gewijzigd tijdens het CAD-proces, waardoor een groot aantal geometrieën kan worden gegenereerd. De combinatie van de flexibiliteit van de CAD met 3D-printen maakt de snelle iteratie van microdeeltjesontwerpen mogelijk. Hoewel dit protocol een multi-foton 3D-printer gebruikt, kan elke 3D-printer met specificaties die in staat zijn om de microstructuurafmetingen in een geschikt materiaal te printen, worden gebruikt om de initiële mastermal te genereren. Verder is fotolithografie eerder gebruikt om vergelijkbare structuren in arrays veel groter te maken dan die geproduceerd in dit protocol; De arbeid, vertraging van het bestellen van op maat gemaakte fotomaskers en de toegankelijkheid van apparatuur zouden het iteratieve ontwerpproces echter vertragen16. Ten slotte kan het genereren van mastermatrijzen worden uitbesteed aan fee-for-service-bedrijven als interne master-matrijsfabricage niet haalbaar is. Ongeacht de 3D-printer of de methode die wordt gebruikt om de mastermallen te genereren, is de hechting van de print op het substraat van cruciaal belang voor stroomafwaartse stappen. In het bijzonder, als de hechting onvoldoende is tijdens het genereren van PDMS-matrijzen, blijven geprinte deeltjes in de PDMS-mal hangen, waardoor handmatige verwijdering van de geprinte deeltjes en vernietiging van de hoofdmal vereist is.
Deeltjesvulling is een ander kritisch aspect om te overwegen. Microdeeltjes hebben beperkte vulcapaciteiten, dus filtratie wordt niet alleen gebruikt om het RABV-antigeen te concentreren, maar ook om voorraadhulpstoffen te verwijderen die anders een groot deel van het kernvolume van microdeeltjes zouden innemen. Gezien de grote omvang van het RABV-antigeen (ongeveer 60 nm bij 180 nm)17 is het echter mogelijk om het antigeen tijdens de centrifugatiestappen gedeeltelijk uit te pelleteren. Om deze reden is het belangrijk om het antigeen te resuspenderen door pipetteren of vortexing na centrifugeren om een hoog herstel van het RABV-antigeen te bereiken. Een sterk geconcentreerde oplossing is ideaal voor het doseren, omdat het de doseercycli vermindert en daardoor de afbraak van antigeen tijdens het vullen beperkt. Viscositeit is echter een belangrijke beperking van piëzo-elektrische doseerrobots die een stabiele druppel vormen, dus het doseren van een oplossing met een zeer hoge concentratie is misschien niet mogelijk of raadzaam. Het verdunnen van de vuloplossing is de gemakkelijkste manier om een stabiele druppelvorming te bereiken, maar antigeenstabiliteit gedurende de extra vulcycli die nodig zijn om de gewenste belasting te bereiken en de langere tijd die nodig is om deeltjes te vullen, moet worden overwogen.
Beperkingen
Deze methode vereist zeer gespecialiseerde apparatuur om de initiële mallen te produceren en een gespecialiseerd vulinstrument voor de productie van microdeeltjes. Hoewel de behoefte aan een 3D-printer met een printresolutie die in staat is om de initiële mastermallen te genereren, kan worden ondermijnd door een fee-for-service-benadering, is de toegankelijkheid tot een piëzo-elektrische doseerrobot beperkt. De aanschaf van een piëzo-elektrische doseerrobot vereist een aanzienlijke initiële investering vooraf, vaak in het bereik van $ 80.000 tot $ 200.000, afhankelijk van het merk, de doorvoer en de mogelijkheden. Hoewel verschillende andere vulmethoden mogelijke alternatieven zijn, zijn deze methoden niet gevalideerd met behulp van het RABV-antigeen12.
Toekomstige toepassingen
Een aanzienlijk deel van het ingekapselde RABV-antigeen bleef stabiel tijdens het afdichtingsproces. In theorie, door dit antigeen op te nemen in deeltjes die zijn samengesteld uit verschillende soorten PLGA die de toedieningstijdlijn van profylaxebehandeling na blootstelling nabootsen, kunnen alle doses in één injectie worden toegediend. Het elimineren van de noodzaak van herhaalde ziekenhuisbezoeken om extra doses toe te dienen, zal de therapietrouw van de patiënt verbeteren, wat resulteert in betere behandelingsresultaten. Voorts is het, na het aantonen van het vermogen om de ELISA-reactiviteit van het zeer complexe geïnactiveerde rabiësvirus te behouden, waarschijnlijk dat andere antigenen, waaronder subunitvaccins, compatibel zouden zijn met deze inkapselingsmethode. Het gebruik van andere profylactische antigenen met GEPULSEERDE microdeeltjes kan miljoenen levens redden in LMIC’s door de vaccinatiegraad van ondergevaccineerde populaties te verhogen. Om dit te bereiken, moeten vaccins echter stabiel blijven door niet alleen inkapseling, maar ook door afgifte, wat een uitdaging kan zijn omdat de lading zal worden blootgesteld aan verhoogde temperaturen en een potentieel zure micro-omgeving als gevolg van lichaamswarmte en PLGA-afbraakproducten18. Toekomstig werk zal streven naar stabiliserende strategieën van het antigeen door middel van afgifte, wat het potentieel zou openen voor een vaccinatieplatform met één injectie dat breed toepasbaar is om veel infectieziekten te voorkomen.
The authors have nothing to disclose.
We danken Chiron Behring en Bharat Biotech International voor het leveren van Particles for Humanity met het RABV-antigeen. We willen ook Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD., bedanken voor zijn onschatbare begeleiding en technische bijdragen. De auteurs willen graag de vrijgevigheid van Dr. Rebecca Richards-Kortum bedanken voor het toestaan van het gebruik van haar SciFLEXARRAYER S3 picoliter doseerapparaat en dr. Chelsey Smith’s instructie over het gebruik van het apparaat. We erkennen ook de Chan Medical School van de Universiteit van Massachusetts voor het genereren van microscopiebeelden van het rabiësantigeen. Tot slot bedanken we Don Chickering en Erin Euliano voor het bekijken van het document voordat ze worden ingediend. Dit werk werd ondersteund door een subsidie (INV-004360) van de Bill and Melinda Gates Foundation.
0.22 µm PES filter | Cole-Parmer+B4B2:B63 | 04396-26 | |
0.25 mm Shims | McMaster Carr | 98090A935 | |
0.75 inch Binder Clips | Staples | 480114 | |
10 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309604 | |
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11E | |
101.6 mm C-Clamp | Amazon | PT-SD-CP01A | Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens. |
19 G needle | EXCELINT | 26438 | |
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11 | |
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate | Millipore Sigma | M6514-25ML | |
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Eppendorf | 22431081 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 352098 | |
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Acetone | Fisher | AC268310010 | |
Aluminum Block | McMaster Carr | 9057K175 | |
Aluminum Foil | VWR | 89079-069 | |
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa | Millipore Sigma | C82301 | |
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated | Fisherbrand | 14-388-100 | |
Carboxymethyl Cellulose | Tokyo Chemical Industries | C0045 | |
ClipTip 300, Filter, Racked | Fisherbrand | 13-678-11 | |
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3206 | |
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3207 | |
Describe | Nanoscribe | Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer. |
|
Desiccator | Fisher Scientific | 10529901 | Or equivalent |
Double-Sided Tape | Staples | 649280 | |
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium | Gibco | 14200075 | |
Ethanol | VWR | 89370-084 | |
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL | Fisherbrand | 03-448-17 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL | Fisherbrand | FB14955202 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL | Fisherbrand | 13-374-10 | |
Fisherbrand Elite Pipette Kit | Fisherbrand | 05-408-137 | |
Fisherbrand Pipet Controller | Fisherbrand | FB14955202 | |
Glass Petri Dish, 90 mm | VWR | 470313-346 | |
Glass Slides | Globe Scientific | 1380-10 | |
Helicon Focus 8 | HeliconSoft | Software used to focus stack images | |
IP-Q Resin | Nanoscribe | Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2 | |
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple | Amazon | 5053485896236 | Or equivalent |
Microscope Slide Box | Millipore Sigma | Z374385-1EA | Or equivalent |
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective | Nanoscribe | ||
NanoWrite | Nanoscribe | Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer. |
|
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. | Fisherbrand | 13-374-10 | |
PDC 60 with Type 3 Coating | Scienion | P-2020 | |
PDMS Particle Molds | Rice University | n/a | N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array. |
Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
Plastic Cups | Fisher Scientific | S04170 | |
PLGA Film, 502H | Sigma | 502H: 719897-1G | |
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate | Millipore Sigma | 484431 | |
Rabies Antigen | Chiron Behring and Bharat Biotech International | Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company. | |
Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Scalpel | VWR | 21899-530 and 76457-512 | |
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 | Scienion | Or equivalent | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | Thermo Scientific | 15036 | |
Silicon Wafer | University Wafer | 1025 | |
Spring Clamps | IRWIN | VGP58100 | |
Stainless Steel Block | McMaster Carr | 9083K12 | |
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive | Fisherbrand | 02-707-404 | |
Sylgard 184 | DOW | 2646340 | |
Teflon Sheet | McMaster Carr | 9266K12 | Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces. |
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick | McMaster Carr | 9266K81 | |
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane | Sigma | 448931-10G | |
Tweezers | Pixnor | ESD-16 | |
UltraPure Distilled Water | Fisher Scientific | 10977015 | |
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker | UVP | 95-0174-01 | Or equivalent |
Vacuum Desiccator | Bel-Art | F420100000 | Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination. |
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C | VWR | 97027-664 | Or equivalent |
Vacuum, CRVpro4 | Welch | 3041-01 | Or equivalent |
Wooden Tongue Depressors | Electron Microscopy Sciences | 72320 |