Este método describe la encapsulación del antígeno de la rabia en micropartículas poliméricas biodegradables con propiedades estructurales y materiales que permiten la liberación pulsátil después de un retraso predeterminado. La evaluación del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) del antígeno recuperado del núcleo de la partícula confirma la presencia de glicoproteína intacta del virus de la rabia trimérica a través de la fabricación de partículas.
Las directrices actuales para la profilaxis posterior a la exposición a la rabia requieren múltiples inyecciones administradas durante varias semanas. Esto puede ser desproporcionadamente oneroso para quienes viven en países de ingresos bajos y medianos (PIBM), donde se producen la mayoría de las exposiciones mortales a la rabia. Se han explorado diferentes estrategias de administración de fármacos para condensar los regímenes de vacunas en una sola inyección mediante la encapsulación de antígenos en partículas poliméricas. Sin embargo, los factores estresantes fuertes durante el proceso de encapsulación pueden causar la desnaturalización del antígeno encapsulado. Este artículo describe un método para encapsular el antígeno del virus de la rabia (RABV) en micropartículas poliméricas que exhiben liberación pulsátil sintonizable. Este método, denominado partículas uniformemente licuadas y selladas para encapsular fármacos (PULSED), genera micropartículas utilizando litografía blanda para crear moldes inversos de polidimetilsiloxano (PDMS) a partir de un molde maestro impreso en 3D con múltiples fotones. Las películas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) se moldean por compresión en los moldes PDMS para generar cilindros abiertos que se llenan con RABV concentrado utilizando un robot dispensador piezoeléctrico. Estas microestructuras se sellan calentando la parte superior de las partículas, permitiendo que el material fluya y forme una barrera polimérica continua y no porosa. Después de la fabricación, se utiliza un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) específico para la detección de glicoproteína intacta del virus trimérico de la rabia para confirmar la alta recuperación del antígeno inmunogénico de las micropartículas.
La vacunación es una herramienta sanitaria extremadamente eficaz, ya que ha evitado más de 37 millones de muertes entre 2000 y 20191. A pesar de esta eficacia, las enfermedades prevenibles por vacunación siguen planteando un riesgo significativo para la salud mundial, especialmente en los países de ingresos bajos y medianos (PIBM), donde las altas tasas de vacunación insuficiente y no vacunada contribuyen a 1,5 millones de muertes prevenibles por vacunación al año2. La rabia no es una excepción a estas disparidades. A pesar de su condición de la enfermedad más mortal conocida por la humanidad, siendo casi universalmente mortal, la rabia es totalmente tratable y está clasificada como erradicada en muchos países de altos ingresos. En cambio, la carga de la rabia es soportada desproporcionadamente por las personas que viven en partes de Asia y África, donde la enfermedad tiene resultados devastadores en los seres humanos y el ganado 3,4.
La vacunación es fundamental para gestionar el impacto mundial de la rabia5. El costo de la vacunación prohíbe la implementación generalizada de la profilaxis previa a la exposición (PrEP), considerando la baja incidencia general de la enfermedad. Además, en los PIBM, la utilidad de la profilaxis posterior a la exposición (PEP) está limitada por las presiones socioeconómicas sobre los pacientes que buscan atención médica. Los factores logísticos, como la distancia de viaje a los puntos de acceso a la atención médica, la pérdida de salarios durante la recepción del tratamiento, el costo del tratamiento, las citas que interfieren con las actividades diarias y el olvido, resultan en tasas de adhesión a la PEP tan bajas como 60%6,7. Esta alta tasa de deserción de pacientes presenta una oportunidad para refinar los enfoques para abordar las brechas en la vacunación contra la rabia con el fin de combatir la enfermedad.
Los sistemas de vacunación de inyección única (SI) que controlan la liberación de antígenos se han explorado como formas de obtener la inmunización completa en una sola inyección. Eliminar la necesidad de múltiples visitas a un proveedor de atención médica mitiga las cargas que impiden que las personas busquen la atención adecuada. Para lograr la vacunación contra el SI, un antígeno generalmente se encapsula dentro de una matriz polimérica biodegradable que a menudo toma la forma de micropartículas inyectables. Una vez inyectado, el polímero se degrada y libera el antígeno secuestrado. Hasta la fecha, se han seguido dos estrategias de liberación primaria para lograr la vacunación contra la IS. En un enfoque, el antígeno se libera continuamente durante un período prolongado de tiempo. Aunque está destinado a mejorar la inmunogenicidad de una sola inyección, no está claro si este enfoque es suficiente para provocar una respuesta inmune protectora contra el virus de la rabia (RABV) en humanos8. En el otro, el antígeno se libera después de un retraso predeterminado para imitar un régimen de vacuna de refuerzo convencional y probado. Los métodos de fabricación de micropartículas basados en el secado por atomización y la evaporación de emulsión/disolvente exhiben la estrategia anterior, y se han utilizado para encapsular con éxito tanto las vacunas modelo9 como los antígenos altamente estables, como el toxoide tetánico10. Sin embargo, estos métodos de encapsulación involucran factores estresantes, incluyendo calor, interacción con solventes y fuerzas físicas, que pueden desnaturalizar antígenos11.
Las partículas uniformemente licuadas y selladas para encapsular medicamentos (PULSED) es un método de fabricación recientemente desarrollado que se puede emplear para encapsular productos biológicos en micropartículas biodegradables. El micromoldeo se utiliza para generar partículas que se llenan con una carga útil líquida y se calientan para permitir que el polímero refluya y encapsule completamente el depósito central de carga dentro de una capa contigua del polímero biodegradable. Esta microestructura da como resultado la liberación pulsátil de la carga útil, después de una duración que depende de la velocidad de degradación de la cubierta polimérica12. Este manuscrito demuestra la encapsulación de RABV inactivado dentro de micropartículas compuestas de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), un polímero biodegradable utilizado en muchas formulaciones aprobadas por la FDA13, utilizando el método de fabricación PULSED para encapsular el antígeno RABV estable evaluado por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Al combinar partículas de PLGA con diferentes pesos moleculares y / o grupos finales, este enfoque tiene el potencial de imitar el curso actual de vacunación contra la rabia después de una sola inyección.
Es posible alterar la geometría de las partículas para necesidades específicas; Sin embargo, para estructuras cilíndricas, los autores recomiendan mantener una relación 5:4:1 de la altura:diámetro:espesor de pared descrita en el protocolo. Esta relación de aspecto garantiza que haya suficiente material PLGA presente para sellar las partículas y permanecer mecánicamente lo suficientemente robusto para su manipulación. Las dimensiones y formas de las partículas se pueden alterar fácilmente durante el proceso CAD, lo que permite generar una gran cantidad de geometrías. La combinación de la flexibilidad del CAD con la impresión 3D permite la rápida iteración de diseños de micropartículas. Aunque este protocolo utiliza una impresora 3D multifotónica, cualquier impresora 3D con especificaciones capaces de imprimir las dimensiones de la microestructura en un material apropiado se puede utilizar para generar el molde maestro inicial. Además, la fotolitografía se ha utilizado previamente para hacer estructuras similares en matrices mucho más grandes que las producidas en este protocolo; Sin embargo, la mano de obra, el retraso en el pedido de fotomáscaras hechas a medida y la accesibilidad del equipo ralentizarían el proceso de diseño iterativo16. Finalmente, la generación de moldes maestros puede subcontratarse a empresas de pago por servicio si la fabricación interna de moldes maestros no es factible. Independientemente de la impresora 3D o el método utilizado para generar los moldes maestros, la adhesión de la impresión al sustrato es fundamental para los pasos posteriores. Específicamente, si la adhesión es inadecuada durante la generación del molde PDMS, las partículas impresas permanecerán alojadas en el molde PDMS, lo que requerirá la eliminación manual de las partículas impresas y la destrucción del molde maestro.
El llenado de partículas es otro aspecto crítico a considerar. Las micropartículas tienen capacidades de llenado limitadas, por lo que la filtración se utiliza no solo para concentrar el antígeno RABV, sino también para eliminar excipientes de stock que de otro modo ocuparían una gran parte del volumen del núcleo de micropartículas. Sin embargo, dado el gran tamaño del antígeno RABV (aproximadamente 60 nm por 180 nm)17, es posible eliminar parcialmente el antígeno durante las etapas de centrifugación. Por esta razón, es importante resuspender el antígeno mediante pipeteo o vórtice después de la centrifugación para lograr una alta recuperación del antígeno RABV. Una solución altamente concentrada es ideal para la dispensación, ya que reduce los ciclos de dosificación y, por lo tanto, limita la degradación del antígeno durante el llenado. Sin embargo, la viscosidad es una limitación importante de los robots dispensadores piezoeléctricos que forman una gota estable, por lo que dispensar una solución de muy alta concentración puede no ser posible o aconsejable. Diluir la solución de llenado es la forma más fácil de lograr una formación de gota estable, pero se debe considerar la estabilidad del antígeno durante los ciclos de llenado adicionales necesarios para lograr la carga deseada y la mayor cantidad de tiempo requerido para llenar las partículas.
Limitaciones
Este método requiere equipos altamente especializados para producir los moldes iniciales y un instrumento de llenado especializado para la producción de micropartículas. Aunque la necesidad de una impresora 3D con una resolución de impresión capaz de generar los moldes maestros iniciales puede ser subvertida por un enfoque de pago por servicio, la accesibilidad a un robot dispensador piezoeléctrico es limitante. La adquisición de un robot dispensador piezoeléctrico requiere una inversión inicial significativa, a menudo en el rango de $ 80,000 a $ 200,000, dependiendo de la marca, el rendimiento y las capacidades. Aunque varios otros métodos de llenado son alternativas potenciales, estos métodos no han sido validados utilizando el antígeno RABV12.
Aplicaciones futuras
Una proporción sustancial del antígeno RABV encapsulado permaneció estable durante el proceso de sellado. En teoría, al incorporar este antígeno en partículas compuestas de diferentes tipos de PLGA que imitan la línea de tiempo de administración del tratamiento profiláctico posterior a la exposición, todas las dosis podrían administrarse en una sola inyección. Eliminar la necesidad de repetir las visitas al hospital para administrar dosis adicionales mejorará el cumplimiento del paciente, lo que resultará en mejores resultados del tratamiento. Además, habiendo demostrado la capacidad de retener la reactividad ELISA del virus de la rabia inactivado altamente complejo, es probable que otros antígenos, incluidas las vacunas de subunidades, sean compatibles con este método de encapsulación. El uso de otros antígenos profilácticos con micropartículas PULSADAS podría salvar millones de vidas en los PIBM al aumentar las tasas de vacunación de las poblaciones insuficientemente vacunadas. Sin embargo, para lograr esto, las vacunas deben permanecer estables no solo a través de la encapsulación sino también de la liberación, lo que puede ser un desafío ya que la carga útil estará sujeta a temperaturas elevadas y un microambiente potencialmente ácido debido al calor corporal y los productos de degradación de PLGA18. El trabajo futuro buscará estrategias de estabilización del antígeno a través de la liberación, lo que abriría el potencial para una plataforma de vacunación de inyección única que sea ampliamente aplicable para prevenir muchas enfermedades infecciosas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Chiron Behring y Bharat Biotech International por proporcionar a Particles for Humanity el antígeno RABV. También nos gustaría reconocer a Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD., por su inestimable orientación y contribuciones técnicas. Rebecca Richards-Kortum por permitir el uso de su aparato dispensador de picolitros SciFLEXARRAYER S3 y las instrucciones de la Dra. Chelsey Smith sobre el uso del dispositivo. También reconocemos a la Facultad de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts por generar imágenes de microscopía del antígeno de la rabia. Finalmente, agradecemos a Don Chickering y Erin Euliano por revisar el documento antes de enviarlo. Este trabajo fue apoyado por una subvención (INV-004360) de la Fundación Bill y Melinda Gates.
0.22 µm PES filter | Cole-Parmer+B4B2:B63 | 04396-26 | |
0.25 mm Shims | McMaster Carr | 98090A935 | |
0.75 inch Binder Clips | Staples | 480114 | |
10 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309604 | |
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11E | |
101.6 mm C-Clamp | Amazon | PT-SD-CP01A | Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens. |
19 G needle | EXCELINT | 26438 | |
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11 | |
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate | Millipore Sigma | M6514-25ML | |
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Eppendorf | 22431081 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 352098 | |
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Acetone | Fisher | AC268310010 | |
Aluminum Block | McMaster Carr | 9057K175 | |
Aluminum Foil | VWR | 89079-069 | |
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa | Millipore Sigma | C82301 | |
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated | Fisherbrand | 14-388-100 | |
Carboxymethyl Cellulose | Tokyo Chemical Industries | C0045 | |
ClipTip 300, Filter, Racked | Fisherbrand | 13-678-11 | |
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3206 | |
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3207 | |
Describe | Nanoscribe | Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer. |
|
Desiccator | Fisher Scientific | 10529901 | Or equivalent |
Double-Sided Tape | Staples | 649280 | |
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium | Gibco | 14200075 | |
Ethanol | VWR | 89370-084 | |
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL | Fisherbrand | 03-448-17 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL | Fisherbrand | FB14955202 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL | Fisherbrand | 13-374-10 | |
Fisherbrand Elite Pipette Kit | Fisherbrand | 05-408-137 | |
Fisherbrand Pipet Controller | Fisherbrand | FB14955202 | |
Glass Petri Dish, 90 mm | VWR | 470313-346 | |
Glass Slides | Globe Scientific | 1380-10 | |
Helicon Focus 8 | HeliconSoft | Software used to focus stack images | |
IP-Q Resin | Nanoscribe | Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2 | |
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple | Amazon | 5053485896236 | Or equivalent |
Microscope Slide Box | Millipore Sigma | Z374385-1EA | Or equivalent |
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective | Nanoscribe | ||
NanoWrite | Nanoscribe | Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer. |
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Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. | Fisherbrand | 13-374-10 | |
PDC 60 with Type 3 Coating | Scienion | P-2020 | |
PDMS Particle Molds | Rice University | n/a | N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array. |
Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
Plastic Cups | Fisher Scientific | S04170 | |
PLGA Film, 502H | Sigma | 502H: 719897-1G | |
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate | Millipore Sigma | 484431 | |
Rabies Antigen | Chiron Behring and Bharat Biotech International | Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company. | |
Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Scalpel | VWR | 21899-530 and 76457-512 | |
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 | Scienion | Or equivalent | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | Thermo Scientific | 15036 | |
Silicon Wafer | University Wafer | 1025 | |
Spring Clamps | IRWIN | VGP58100 | |
Stainless Steel Block | McMaster Carr | 9083K12 | |
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive | Fisherbrand | 02-707-404 | |
Sylgard 184 | DOW | 2646340 | |
Teflon Sheet | McMaster Carr | 9266K12 | Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces. |
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick | McMaster Carr | 9266K81 | |
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane | Sigma | 448931-10G | |
Tweezers | Pixnor | ESD-16 | |
UltraPure Distilled Water | Fisher Scientific | 10977015 | |
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker | UVP | 95-0174-01 | Or equivalent |
Vacuum Desiccator | Bel-Art | F420100000 | Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination. |
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C | VWR | 97027-664 | Or equivalent |
Vacuum, CRVpro4 | Welch | 3041-01 | Or equivalent |
Wooden Tongue Depressors | Electron Microscopy Sciences | 72320 |